铁死亡在多形性胶质母细胞瘤治疗中的研究进展

斯 宝, 张刚利, 胡昌辰

(山西医科大学第五临床医学院 神经外科, 山西 太原, 030000)

细胞死亡是存在于所有生物体中的一个共有过程，根据2018年细胞死亡命名委员会的最新建议，目前有2种类型的细胞死亡: 意外细胞死亡(ACD)和调控细胞死亡(RCD)[1]。ACD是由化学、物理或机体严重应激等引起的不受控制且不可避免的细胞死亡过程，与之对应的RCD则可以通过物理、化学等干预来调控。RCD又分为凋亡型和非凋亡型(铁死亡、坏死性凋亡、细胞焦亡和碱死亡等)，这2种类型具有不同的分子特征，因此对于疾病的影响也存在很大差异[2]。细胞铁死亡是一种区别于细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬的新型铁依赖性细胞程序性死亡方式。从形态学角度看，细胞铁死亡具有典型的坏死样改变特征，如细胞水肿、质膜破裂。从生物化学角度看，铁死亡具有产生致命程度的铁依赖性脂质过氧化的特点[3]。然而，细胞凋亡的经典生化特征，如染色质碎裂、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶激活和线粒体细胞色素C的释放，在铁死亡中则很少存在。虽然铁死亡最初被定义为一种与自噬无关的细胞死亡，但越来越多证据[4]表明，自噬特别是选择性自噬在促进细胞铁死亡过程中发挥着重要作用。研究[5]表明，细胞铁死亡在多形性胶质母细胞瘤(GBM)治疗中发挥着重要作用。

1 GBM

GBM属于Ⅳ级胶质瘤，占所有颅内肿瘤的12%～15%, 其在胶质瘤中恶性程度最高，预后最差，5年生存率仅为 5%[6]。目前, GBM最有效的治疗方法是最大程度切除肿瘤并尽可能保留脑功能，术后辅助放疗和采用替莫唑胺 (TMZ) 化疗[7]。过去几年GBM手术和放化疗方案取得了一定程度进展，但患者平均生存期仍仅为 15 个月左右[8]。导致预后不良的原因包括以下几点: 首先, GBM往往边界不清且与正常脑组织难以完全分离，较少有进行二次手术的机会[9]; 其次，血脑屏障 (BBB) 的存在和肿瘤细胞的快速增殖常导致肿瘤血管化不足，这使化疗药物难以到达目标位置发挥疗效[10]; 最后, GBM存在广泛的肿瘤异质性，这可能导致一系列多变的生物学反应。GBM瘤内分子异质性是临床对抗复发、侵袭所面临的主要难题。GBM瘤内分子异质性具有两面性: 一方面其可作为预后标记物指导GBM个体化治疗; 另一方面其又是导致分子靶向治疗失败的因素。研究[11]表明，GBM的遗传改变主要涉及3大信号通路: 磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)相关信号通路、P53相关信号通路 和RB相关信号通路。因此，单一疗法方案通常会导致肿瘤变异和肿瘤耐受性增大，进而引起肿瘤复发和产生复杂的肿瘤异质性，而靶向通路治疗能够针对性地作用于一类高表达特定蛋白的细胞亚群，且不影响其他正常细胞。

此外，胶质瘤干细胞是一个不断增殖的胶质细胞瘤细胞亚群，具有高致瘤能力、无限自我更新和多向分化潜能，在初始治疗期间对抗癌药物的敏感性常表现出广泛的肿瘤间异质性[12]。同时，胶质瘤干细胞对放疗和化疗具有强耐受性是胶质瘤复发的重要因素[10]。

2 铁死亡通路的一般机制

2.1 氨基酸代谢和铁死亡

研究[13]发现，半胱氨酸/谷胱甘肽耗竭途径可导致脂质过氧化，进而发生细胞铁死亡。胱氨酸/谷氨酸反向转运系统(system Xc-)由溶质载体家族7成员11(SLC7A11)重组蛋白和溶质载体家族3成员2(SLC3A2)重组蛋白载体组成，可以参与包括生产还原型谷胱甘肽在内的一系列代谢反应。L-胱氨酸通过谷氨酸的system Xc-进入细胞。首先，L-半胱氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的作用下转化为γ-谷氨酰半胱氨酸，然后在谷胱甘肽合成酶和甘氨酸的作用下进一步转化为谷胱甘肽[14]。谷胱甘肽作为活性氧自由基(ROS)的一种清除剂，可被氧化成谷胱甘肽二硫化物(GSSG), 维持细胞氧化还原平衡。

谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)具有清除脂质过氧化物的功能，失活的Gpx4可打破氧化平衡，导致脂质过氧化物破坏膜结构，激发铁死亡[15], 因此其是唯一一种通过消耗还原型谷胱甘肽将膜脂过氧化氢(LOOH)还原为无毒脂醇(LOH)的酶。由于Gpx4主要利用抗氧化剂谷胱甘肽来降低脂质过氧化氢，因此Gpx4的活性在很大程度上依赖于细胞内的谷胱甘肽水平。抑制Gpx4活性可导致过度的脂质过氧化，继而发生细胞铁死亡，例如RSL3 Gpx4抑制剂能通过降低 Gpx4 的表达诱导细胞发生铁死亡。尽管Gpx4在铁死亡中起着至关重要作用，但某些癌细胞对Gpx4抑制剂引起的铁死亡具有抗性，这表明铁死亡可能还受其他因素调节[16]。

2.2 脂质代谢和铁死亡

多不饱和脂肪酸(PUFAs)是铁死亡的关键成分。PUFAs要导致铁死亡首先必须先转变为磷脂酰乙醇胺(PE)多不饱和脂肪酸[17]。PE-PUFAs是由乙酰辅酶A合成酶长链脂肪成员4(ACSL4)在溶血磷胆碱酰基转移酶3的作用下形成的。在15-脂氧合酶(LOX)和亚铁离子(Fe2+)的作用下, PE-PUFAs可发生脂质过氧化，进而导致细胞铁死亡。

2.3 铁离子代谢和铁死亡

铁在细胞代谢中主要以2种形式存在: Fe2+和三价铁离子(Fe3+)。血液中的Fe3+附着在转铁蛋白受体(TFR)-1上，通过胞吞作用进入细胞内。进入细胞内的Fe3+被前列腺6次跨膜蛋白3 (STEAP3)还原为Fe2+, 然后通过内膜的二价金属转运体1(DMT1)进入细胞质。亚铁通过铁死亡的负性调控因子铁蛋白离开细胞[18]。在过氧化氢(H2O2)的作用下, Fe2+可发生芬顿反应[19](双氧水和过渡金属如Fe2+之间的反应是羟基的主要来源)产生ROS。研究[20]表明，低而可控的ROS水平对正常的细胞和机体功能至关重要，中等水平的ROS水平有利于肿瘤发展，但高水平的ROS会导致细胞损伤和死亡。

2.4 FES1-NADPH通路和铁死亡

研究[21]表明，在Gpx4基因敲除的细胞中发现，铁死亡抑制蛋白1(FSP1)具有和Gpx4相似的作用, FSP1也称为线粒体相关凋亡诱导因子2(AIFM2)或p53反应基因(PRG3)。

FSP1是一种NADPH依赖的辅酶Q10(CoQ10)氧化还原酶，其作用是将细胞壁中的泛醌Q10转化为泛酚Q10。泛酚作为ROS清除剂可以防止发生铁死亡特征的脂质过氧化。研究[22]发现, FSP1可以通过非依赖性辅酶Q10途径阻断药物诱导的铁死亡，因此FSP1抑制铁死亡的确切机制还需要进一步研究。研究[23]发现，在多种癌症中, FSP1水平与较低的总生存率和无病间隔时间显著相关，并可作为预后标志物。临床治疗中发现和了解这些代偿途径十分重要，因为通过增加Gpx4来促进癌细胞发生铁死亡可能会因为这些代偿机制的激活而无法达到预期效果。

上述途径的任何改变都会阻碍或促进铁死亡。例如，细胞内Fe2+的增加和谷胱甘肽生成的减少可导致ROS增加和脂质过氧化; 抑制Gpx4会阻碍过氧化脂质向脂醇转化，而过氧化脂质的增加会破坏细胞器和细胞膜的结构导致膜通透性丧失，最后发生细胞铁死亡。

3 细胞铁死亡在癌症中的治疗潜力

近年来，研究人员发现，铁死亡存在于乳腺癌、肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌和肝细胞癌等多种癌症中，联合应用铁死亡激活剂与抗肿瘤药物或者诱导肿瘤细胞发生铁死亡均有利于对肿瘤的干预、抑制和清除[24-26]。已有实验[27]证明，在Ptgs2基因高表达的BJeLR细胞来源的异种移植小鼠模型中，铁死亡阳性调控因子RSL3可抑制肿瘤生长，而Ptgs2是RSL在肿瘤细胞中导致铁死亡的特异性标志物。Gpx4是RSL3的主要靶点，可特异性地诱导含有HRAS的BJ源性成纤维细胞发生铁死亡，敲除Gpx4基因可诱导肾癌铁死亡[27]。此外，铁死亡诱导剂还可与顺铂、替莫唑胺、阿糖胞苷和阿霉素等药物联合应用于不同类型癌症的抗癌治疗。研究[28]表明，细胞密度也可以影响其对铁死亡的敏感性，铁死亡诱导剂可促进线粒体活性氧自由基(MitoROS)的产生，导致线粒体通透性转换孔(MPTP)开放，进而导致线粒体消失和ATP耗尽[29]，见图1。因此，研究人员推测MitoROS在破坏线粒体稳态和铁死亡的过程中起到了正反馈作用。

新的技术已经开始应用于铁死亡在癌症治疗中的研究。例如，因铁死亡能以波状方式在细胞群中扩散，已有一些研究小组开始尝试使用纳米粒子以精确诱导肿瘤组织中癌细胞的铁死亡。有研究[30]通过 Fe3+/Gd3+与多酚的螯合反应，将两亲性高分子骨架(P-SS-D)、肉桂醛前体药物(CA-OH)和Fe3+/钆离子(Gd3+)结合，设计了一种热塑性纳米晶，当纳米颗粒被投放到高谷胱甘肽水平的肿瘤微环境中时，其可被 P-SS-D 的多硫化物主链解聚，激活的CA消耗谷胱甘肽使内源性H2O2产生羟自由基(·OH), 同时抑制Gpx4的活性。二硫化物、CA和 Fe3+对谷胱甘肽的消耗可使 Gpx4减少并产生羟基，加速脂质过氧化物的积累，从而促进铁死亡的发生。

LipRO: 脂质活性氧; DFO: 铁离子螯合剂去铁胺; GSH: 谷胱甘肽; GPX4: 谷胱甘肽过氧化物酶4; Cys: 胱氨酸; systemXc-: 胱氨酸/谷氨酸反向转运系统; Tf: 转铁蛋白; TFR1: 转铁蛋白受体; DMT1: 二价金属离子转运体; STEAP3: 前列腺6次跨膜蛋白3; Lip-ros: 脂质活性氧; VDACs: 线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白; PUFA: 多不饱和脂肪酸。图1 铁死亡通路

4 GBM与细胞铁死亡的关系

近年来越来越多的研究[31]已经开始探索铁在神经系统中的作用机制。研究在脑毛细血管的表面发现了转铁蛋白受体。转铁蛋白(Tf)已被证明通过受体介导的胞吞作用进入大脑内皮细胞，随后进入大脑。Tf代谢失调会导致大脑中的不稳定铁增加，而不稳定铁的增加会导致脂质过氧化。事实上，这主要取决于芬顿反应和脂氧合酶LOX。对于这个反应，循环中必须要求有足够的不稳定铁。铁死亡导致的不稳定铁含量增加正好符合这一条件。研究结果显示，抗氧化剂如铁螯合剂、去铁胺等，可以终止此反应，减少细胞内的铁含量，抑制铁依赖的脂质ROS的产生。

研究[32]表明，转铁蛋白在GBM中的表达程度远高于其他级别胶质瘤，并且衡量氧化应激水平的8-羟化脱氧鸟苷(8-OHdG)也处于首位，说明肿瘤细胞恶性程度与细胞铁死亡的发生具有正相关。Tf是血浆中发现的一种80 kDa的糖蛋白，是细胞增殖中必不可少的生长因子，能够结合铁，因此Tf可作为铁通过血液进入脑细胞的载体。但是并非所有大脑区域都存在Tf, 其主要存在于少突胶质细胞、脑脊液和脑毛细血管内皮细胞中。

大脑和神经胶质母细胞瘤中铁代谢的调节是通过一组特定的蛋白质来完成的，这些蛋白质可以调节肿瘤细胞中铁的浓度。研究[33]表明, BBB是血液和大脑之间的独特结构，严密调节离子和分子进出大脑的运输。构成BBB的内皮细胞主要通过 Tf/TFR1 途径吸收并介导 Fe2+从血管转运至大脑[34]。脑细胞吸收铁有2种基本方式: 第1种是 Tf/TFR1 途径，大多数细胞外铁以Fe3+形式存在，与血浆中的循环 Tf 结合，然后与细胞表面的 TFR1 结合并通过胞吞作用进入细胞; 第2种是非 Tf 结合的铁途径，Fe3+通过十二指肠细胞色素b和朊病毒蛋白被还原为Fe2+，其再由ZIP家族成员 (ZIP8/14) 或二价金属转运蛋白1(DMT1) 运输，见图1。每个同工型DMT1都遵循不同的途径并具有不同的位置。特别是在不同的脑细胞中，铁外流由铁转运蛋白(FPN1)/铜蓝蛋白和FPN1/膜铁转运辅助蛋白(Hp)通路介导。

相对于正常脑组织，GBM对铁的需求显著增加。GBM不仅增加了TFR1的表达以吸收更多的铁，而且还增加了不受铁水平调节的 TFR2[32]，可能破坏正常的铁代谢平衡，使癌细胞吸收更多的铁。此外，TFR和铁蛋白轻链(FTL)表达增加可导致铁摄入量增大，因此神经胶质瘤干细胞的铁摄入量比非干细胞肿瘤高2倍。单细胞磁泳法分析胶质瘤干细胞和非干细胞肿瘤细胞的铁吸收效率和铁含量的实验[5]表明，前者具有更出色的铁吸收和铁储存能力。胶质瘤恶性程度还与一系列促进铁吸收的调节因子的表达增加有关，包括 DMT1、STEAP3、多聚结合蛋白 (PCBP) 2和可改变铁储存能力的FTH、FTL等。STEAP3可通过激活STAT3-FoxM1轴促进TFR1的表达并增加细胞铁含量，从而在GBM中诱导上皮间质转化 (EMT), 这是GBM侵袭和转移的有效机制[35], 见图1。STAT3的激活还可抑制ACSL4表达并保护细胞避免发生铁死亡。最近报道[36]显示，缺氧诱导的FTL可调节EMT并可作为预后标志物。研究表明，GBM细胞分裂的活跃程度受其对铁需求量的影响，这些发现与GBM具有极高的恶性度和病死率相符。

目前，治疗GBM的一线药物是TMZ，TMZ在DNA复制过程中形成不匹配的致死碱基对，导致DNA单链和双链断裂，最终导致细胞凋亡[37]。然而，TMZ的临床表现并不令人满意，除了已知的O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)和错配修复系统机制，TMZ还能激活核因子Nrf2和转录因子4 (ATF4)，增加对铁死亡的抵抗[38]。这些机制有助于维持细胞内稳态和增加GBM的化疗耐药性。TMZ被证明选择性地诱导了神经胶质瘤干细胞的铁死亡，而不是凋亡或坏死。嗜铁诱导药物也可增加TMZ敏感性。以上研究[39]表明，GBM细胞对铁有很强的依赖性，铁死亡不仅参与TMZ的耐药过程，而且还参与GBM的致敏过程。

在此基础上，研究人员开始应用铁螯合剂治疗GBM, 以期延长GBM患者生存期。应用螯合剂可以阻止细胞周期，通常是阻止G0/G1期，导致细胞发生凋亡。临床研究[40]表明，铁螯合剂是潜在的新的抗肿瘤药物。神经母细胞瘤细胞和神经母细胞瘤儿童的早期研究[41]表明，铁离子螯合剂去铁胺(DFO)具有抗增殖和抗肿瘤作用。然而也有报道表明，其具有很强的毒副作用，去铁酮已被证明具有抗增殖和细胞毒性作用。但是在人类神经母细胞瘤的啮齿动物异种移植模型中，其未能延缓肿瘤的生长[42]。因此铁螯尚不足以作为一种治疗GBM的手段，其问题主要在于缺氧诱导因子-1(HIF-1)通路的非特异性作用和潜在的激活可能[43]。因此，通过药物载体系统进行靶向运输或者合成新的具有特异性定向能力的铁螯合剂是有必要的。铁螯合剂作为一种新的GBM治疗药物，可减少肿瘤细胞内铁含量，导致铁蛋白表达水平降低，TFR1表达增加从而延长GBM患者的生存期[44]。铁和GBM存在复杂的关系，铁可能通过激活ROS的产生或HIF-1的信号通路不同程度地影响GBM的治疗。最近的一项研究[45]表明，抑制核因子KB(NF-KB)信号不仅可导致铁蛋白重链表达不足还可以导致细胞活性铁和ROS的产生增加，进而导致细胞死亡。因此，在这种情况下DFO可阻止ROS的产生，使其不能诱导细胞死亡。

此外，铁螯合剂水杨醛异烟酰腙可显著降低GBM细胞对电离辐射的敏感性，这种辐射防护作用可能是由硅依赖的溶酶体经辐射诱导后稳定性增加导致[46-47]。辐射前或辐射期间使用高分子量DFO(仅定位于溶酶体内)可防止发生细胞死亡[48]。此外，Tf可增强铁螯合剂对GBM细胞的放疗敏感性[49], 但是抑制β2-微球蛋白/血色素沉着症(HFE)复合体可诱导铁超载和随后的ROS产生以及减少DNA修复酶增加前列腺癌细胞对放疗的敏感性[50]。这些观察结果显示，发生于不同细胞内铁的还原作用可能对肿瘤细胞的辐射清除有不同的影响，因此使用铁螯合剂作为抗肿瘤药物可能并不总是适用。

铁螯合剂对细胞内铁的还原作用可抑制PHD的活性，从而激活HIF-1途径，增强GBM的侵袭性。DFO导致游离铁缺乏，其除了可诱导HIF-1的激活，还可以促进尿激酶型纤溶酶原激活物(UPAR)和基质金属肽酶2(MMP2)的表达，从而降解GBM细胞外基质而增强GBM侵袭性[44]。DFO的细胞毒性作用可能是由于其可使血管生成因子表达增加导致[51]。

5 小 结

综上所述，应用铁螯合剂治疗GBM必须保持谨慎，参与铁代谢的酶的调节是否因GBM治疗(包括放射治疗和TMZ治疗)而发生变化的问题有待于解决，这些变化对延长GBM患者生存期是否有效仍有待确定。因此，应用铁螯合剂来治疗GBM就必须探索出合适的治疗方案，以确保达到预期的治疗效果。

研究[52]发现，铁死亡在T细胞介导的抗肿瘤免疫中可影响免疫治疗的效果，因为免疫治疗除了可诱发肿瘤性铁死亡外，T细胞本身也可能发生铁死亡，从而减弱其免疫反应。缺乏Gpx4的T细胞可迅速积累膜脂质过氧化物，同时发生铁死亡，因此通过Gpx4抑制剂在癌细胞中治疗性诱导铁死亡可能会对T细胞产生不必要的靶向效应，并产生毒副作用。因此，未来对GBM中结合免疫治疗的铁死亡调节方式仍需进一步探索，以期为治疗GBM提供新的思路和方法，从而进一步延长GBM患者的生存期。