人胎脑来源神经干细胞移植后的致瘤性研究

尹玉柱 梁久红

干细胞是一类具有长期（或无限）自我更新、增殖及多向分化潜能，能产生某种（或多种）特殊功能细胞的原始细胞，它是生命起源、组织器官发育和损失后再生修复的基础，具有重要的研究和应用价值。自1951年至今，干细胞研究在血液系统疾病、免疫系统疾病、肿瘤、糖尿病、肠炎、代谢性疾病、肝病、急重症感染以及神经系统疾病等方面取得了一定成果[1～9]，但在脑、脊髓等神经系统疾病方面进展比较缓慢，可能与人神经干细胞获得、提存、培养、扩增及应用途径和安全系数等有关。神经系统（尤其是中枢神经）损伤和退化，最终要由神经干细胞来解决。有研究用人类胚胎干细胞来源的少突先驱胶质细胞治疗颈脊髓损伤大鼠，注入该细胞1周后，大鼠的运动能力恢复至正常大鼠的97%[10]；2017年国内学者开展了人胚胎干细胞来源的神经前体细胞治疗帕金森病、人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞治疗干性年龄相关性黄斑变性的临床研究[11]。上述研究均未采取直接移植人胎脑神经干细胞，因有证据显示人胚胎干细胞植入裸鼠体内能够形成畸胎瘤[12]。异体人胎脑神经干细胞（即来源于新鲜弃胎的胎脑神经组织）移植后是否有致瘤性、是否会发生异体免疫排斥反应等问题仍未明确。本研究探讨移植原代人胎脑神经干细胞后是否具有致瘤性，以期为其下一步临床试验和应用的安全性及可行性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与器材

1.1.1 细胞系 来自于人胚胎发育早期阶段的原代胎脑神经干细胞由吉林大学通源生物工程有限公司提供，细胞剂量1×108个/ml。Hela细胞由华东师范大学生命医学研究所提供。

1.1.2 实验动物 8周龄的免疫缺陷小鼠BALB/c，来源于华东师范大学实验动物中心，实验前常规适应饲养1d。

1.1.3 主要试剂及器材 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）购自Gibco公司，HE染色试剂盒（Giemsa）、0.9%氯化钠注射液购自上海百特医疗用品有限公司，恒温箱（江苏恒创实验设备有限公司），流式细胞仪（BD公司，BD FACSCaliburTM Flow Cytometer）。

1.2 试验方法 实验分为3组：实验组、Hela细胞阳性对照组及DPBS阴性对照组，每组20只小鼠（雌雄各10只）；注射方式为肋部皮下单次注射，注射体积为0.2ml/只，实验组注射原代人胎脑神经干细胞2×107个/只，Hela细胞阳性对照组注射Hela细胞1×106个/只，DPBS阴性对照组注射DPBS 0.2ml/只。每天观察小鼠行为活动、腺体分泌、粪便形态及体表粘膜等一般生理指标并记录。于注射后第1、2、3、6个月对部分小鼠注射部位进行病理切片检查（HE染色），每次每组随机解剖5只，以确定其是否发生瘤变，记录结果。

1.3 统计学分析 使用SPSS 20.0统计学软件对所得数据进行分析，计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般状态观察 在注射后6个月内，实验组和DPBS阴性对照组小鼠精神及行为活动、腺体分泌、粪便形态、体表粘膜等均无明显变化；Hela细胞阳性对照组小鼠在注射Hela细胞1个月左右陆续出现精神较差、行动迟缓、粪便成黄褐色伴不成形等，个别小鼠眼睛有眼屎。

2.2 小鼠注射部位观察、病理切片及HE染色 通过注射后6个月的观察，实验组与DPBS阴性对照组小鼠肋部皮下注射点位置均无肿块或瘤体形成；Hela细胞阳性对照组所有小鼠在注射后2周左右肋部皮下注射点部位逐渐有瘤体形成，1个月左右在注射部位有明显的瘤块形成，2个月后注射部位可见1～1.2cm3的瘤组织生成。将注射后2个月的小鼠处死，取注射部位组织进行病理切片和HE染色（见图1），DPBS阴性对照组和实验组均呈现正常皮肤组织形态学结构，胞体丰富、束状排列；而Hela细胞阳性对照组则呈现典型的瘤组织结构，细胞致密、无规则排列。第3个月、第6个月的病理切片和HE染色结果与第2个月相同。

图1 注射后2个月小鼠注射部位病理切片

2.3 小鼠注射部位瘤变情况比较 与注射前相比，在注射后6个月内，实验组和DPBS阴性对照组小鼠一般状态的变化率为0，注射部位成瘤/成肿块率为0；Hela细胞阳性对照组小鼠一般状态的病态变化率为100%，注射部位成瘤率为100%，差异具有统计学意义（P<0.01）。

3 讨论

人类是多细胞物种，人体由数以百万亿计的细胞构成。人体的所有行为活动、生理状态以及病理变化，都是细胞状态和功能变化的具体体现。疾病是某些细胞衰老、病变的综合反应。人类细胞是有寿命的，是有限资源，所以人体要经过生老病死过程，而这个过程是由自体先天性固有干细胞资源决定的。细胞包括干细胞和终末分化的各种功能细胞，所有细胞都来源于干细胞。干细胞是人体生长发育、维持新老细胞稳态更新以及组织/器官再生、修复的基础，但人类干细胞的寿命也是有限的，遵循增龄、增代性衰减的自然规律，所以，补充（即移植）异体干细胞无疑是防治疾病、抗衰、延长生命的一种可期选择。神经干细胞更是如此，人体出生时为神经系统（尤其是脑、脊髓等中枢神经）预留的干细胞极其有限，这是导致临床上神经系统疾病难以治愈的关键因素或根本原因。移植人异基因个体神经干细胞，以补充其不足，提高神经系统的再生修复能力，是从根源上防治神经系统各种疾病的根本方法。但其最大障碍是移植干细胞的致瘤性，以及与受体之间的免疫排斥反应问题。之前已有成体神经干细胞致瘤性的相关研究[13，14]，但其取材、传代、扩增以及应用等明显受限；本研究以人胎脑来源的原代神经干细胞（即胚胎神经干细胞）为研究对象，探讨其移植后的致瘤性，从而为解决可临床应用的人神经干细胞资源匮乏，预防和治疗神经系统疾病（尤其是小儿脑瘫，神经损伤，脑/脊髓增龄性、退行性改变等）提供新思路。

可用于移植的不同来源人神经干细胞各具优缺点：①自体干细胞：属于成体神经干细胞范畴，优点是无免疫排斥反应；缺点是呈增龄、增代性功能老化的生物学特性，而非神经干细胞转分化成可用的神经干细胞难度极大。②诱导性多能干细胞（iPSCs），属于人工重编辑的干细胞，无伦理道德问题，不需要HLA配型，但有成活性低、有效性和可控性不确定、有致瘤性和脱靶性等风险。③异基因/异体神经干细胞：成体神经干细胞，包括成人骨髓源性神经干细胞、传数代后的干细胞及其诱导分化的功能细胞、体外诱导性转分化的神经干细胞等，其取材、传代、扩增以及时效性等方面明显受限，需要HLA配型，否则移植后易发生异基因免疫排斥反应等问题，风险系数高。人胎脑神经干细胞，来源于孕4～12周、其父母已经放弃、非病理性流产的新鲜弃胎，吉林大学通源生物工程有限公司通过独特的干细胞分离纯化、培养、鉴定等技术获取，经免疫学、微生物学以及分子生物学等检测合格，具有自我更新、增殖能力强以及极低免疫原性等生物学特性，移植可不需严格的HLA配型。本研究选用的是原代干细胞，免去了因培养、传代等可知或不可知因素的影响，实验结果更趋客观、真实。结果显示：Hela细胞阳性对照组具有显著的成瘤性，而实验组移植的人胎脑神经干细胞与DPBS阴性对照组结果一致，无致瘤/成瘤性。人胎脑神经干细胞的移植与应用比较安全，有较强的可行性，但其作用机制尚不明确，可能为：①通过细胞间接触调节免疫细胞，或分泌可溶性细胞因子、SC-EVs等发挥免疫调节和免疫抑制功能[15～17]；②通过分泌细胞因子、外泌体或细胞间接触，调节和激活受体自身的休眠干细胞及（或）老代干细胞，增殖、分化产生新功能细胞，进行细胞更新、组织再生与修复；③通过干细胞替代机制，即人胚胎神经干细胞因免疫原性极低、免疫耐受而存活，并能够如同受体自体干细胞一样进行自我复制、增殖、分化，产生相应的健康功能细胞，以补充和更新替换衰老、病变细胞，恢复或重建神经网络。

综上所述，人胎脑神经干细胞可能参与和提升受体神经组织的稳态更新、再生修复过程，有望解决临床及科研中人神经干细胞资源匮乏等难题。但也有因实验裸鼠数量不足以及选取的人胎脑神经干细胞发育阶段不同等因素而出现致瘤风险的可能，之后我们将进行人胎脑来源神经干细胞致瘤性的分子遗传学研究来进一步验证。同时，人胚胎干细胞的伦理道德和应用标准等问题亦亟待解决。