酒精依赖伴高脂大鼠海马TGF-β/Smad表达变化及其对认知功能的影响

江清梅 任宇航 朱晓峰 尹昌浩

随着人口老龄化进程的日益加快，老年病逐渐增加，其中以痴呆最为常见[1]。痴呆作为世界范围内备受关注的社会问题，其病因研究逐渐深入。在注重饮食健康的现代社会中，高脂饮食及酒精依赖对认知障碍的影响越来越受到重视。流行病学研究表明，高脂饮食及酒精依赖与痴呆相关，酒精通过影响海马回路损害空间学习记忆能力[2]。研究还表明，高脂饮食及酒精依赖导致痴呆的病理学改变，包括大脑中的β-淀粉样蛋白沉积和神经炎斑块形成，并加重学习和记忆障碍[3]。尽管高脂饮食和酒精依赖对海马神经元损伤已被证实存在，但其分子机制尚不清楚。

转化生长因子β（TGF-β） 有3种亚型（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3），是一个由约100种不同蛋白质组成的大型多效性超家族，参与发育、疾病和组织修复关键步骤的调节。在中枢神经系统（CNS）中，TGF-β/Smad信号通路由神经胶质细胞和神经元细胞产生，并参与基本的组织功能。有动物研究证明，在海马、齿状回和扣带回皮层中观察到特别强的Smad3 mRNA、Smad4 mRNA的原位杂交信号[4]。最近研究表明，痴呆患者大脑中TGF-β1含量异常增加，神经胶质细胞产生的细胞因子、趋化因子和自由基可能会促进炎症、氧化状态和TGF-β1慢性过度分泌，从而促进微血管变性[5]。TGF-β/Smad作为促炎因子相关通路，对神经退行性疾病有明显影响，因此，高脂饮食和酒精依赖相关认知障碍可能与海马内TGF-β/Smad通路所致炎症发生有关。本研究主要探讨高脂饮食及酒精依赖对雄性SD大鼠学习记忆能力的影响，同时检测海马中TGF-β1、P-Smad3和Smad4表达情况。

1 材料与方法

1.1 动物分组及造模 8周龄（200±20）g雄性SD大鼠20只，由牡丹江医学院比较医学中心提供，动物许可证号为SYXK（黑）2019-006，室温（20±2）℃，光照/黑暗比例12h:12h。经过适应性喂养1周后，按随机区组法将大鼠分为对照组（n=4）、酒精组（n=8）、酒精+高脂饮食组（n=8）。对照组、酒精组给予正常饲料，酒精+高脂饮食组给予高脂高糖饮食；各组均采用单瓶自由饮方式摄入液体，对照组饮用无菌水，酒精组、酒精+高脂饮食组第1周饮用3%的酒精，之后逐渐增加酒精浓度，即每周增加3%，直至第4周增加至12%[6]。

1.2 主要试剂及仪器 高脂高糖饲料（小黍有泰生物科技有限公司，北京），伊红染色液（索莱宝G1100），苏木素染色液（索莱宝G1140），β-Actin（Cell Signaling 8457T），P-Smad3一抗（Cell Signaling 9520），Smad4一抗（Cell Signaling 46535），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（碧云天A0208）。Morris水迷宫（成都泰盟软件有限公司），正置显微镜（德国徕卡公司），超灵敏多功能成像仪（美国GE公司）。

1.3 Morris水迷宫实验 造模28d后，各组大鼠进行Morris水迷宫（直径120cm，高50cm，成都泰盟软件有限公司）实验。水箱通过成像线分成4个象限，将平台（直径15cm）置于第一象限水位下方1cm处（不可见），限时60s，规定大鼠进水至站立平台的时间为潜伏期，对大鼠运动轨迹录像；若超出60s仍未站立平台，则人工引导并停留15～30s。整个实验共7天，每天重复2遍，最后一天撤除平台，对大鼠到原平台区域的潜伏期及次数做记录。

1.4 显微镜观察大鼠海马神经元结构 所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35ml/100g）进行麻醉，断头解剖海马，每组取2只大鼠的海马组织由4%多聚甲醛进行固定，其余海马组织-80℃冰箱进行保存，完成后续实验。多聚甲醛固定72h后经梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片、烘片后进行HE染色，在显微镜下拍照记录各组大鼠海马神经元结构。

1.5 ELISA试剂盒检测各组大鼠海马中TGF-β1含量 从-80℃冰箱取出各组海马组织，由预冷的PBS清洗，称取15mg，按照1:9的重量体积比量取含有蛋白酶抑制剂的PBS，于冰上充分研磨，4℃下12 000r/min离心15min，取上清，在TGF-β1包被的微孔中加入标准品、样本、HRP标记的检测抗体，经过37℃温育及洗板、显色，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

1.6 蛋白质免疫印迹法（Western-blot）检测海马中P-Smad3、Smad4的表达 用预冷的PBS清洗各组海马组织20mg，按照1：10的比例加入含有蛋白酶、磷酸酶抑制剂的裂解液，充分研磨、离心、取上清，各组完成提取蛋白后，进行电泳，转膜，牛奶封闭1h，用P-Smad3一抗（1:1000）、Smad4一抗（1:1000）和抗β-actin抗体（1:1000）孵育过夜。洗膜后用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（1:1000）孵育1h，洗膜后涂加显色剂、曝光。

1.7 统计学分析 使用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析，图像分析测量软件为Image J，数据表示为平均值±平均值的标准误差（±S.E.M.）。多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）后进行LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 酒精及高脂饮食对大鼠学习记忆能力的影响 造模28d后，测试3组大鼠记忆能力，定位航行训练中，3组大鼠的潜伏期逐渐缩短，但是与对照组相比，2个模型组的潜伏期均延长，且在第6天时差异具有统计学意义（P<0.05），见表1。通过监视系统的大鼠运动轨迹来看，在经过6天训练期后，对照组大鼠运动轨迹平短，趋向性强，很快找到平台；酒精组大鼠较对照组大鼠趋向性差，需要较长时间才能找到平台，说明记忆力有损；酒精+高脂饮食组大鼠运动轨迹复杂、混乱，趋向性最差，多成边缘化运动轨迹，见图1。空间探索实验中，对照组经过原平台位置次数为（6.00±0.91）次，酒精组为（4.25±0.53）次，酒精+高脂饮食组为（3.60±0.46）次，差异具有统计学意义（P<0.05），表明酒精组、酒精+高脂饮食组大鼠记忆力严重受损。

表1 各组大鼠定位航行训练潜伏期（s）

图1 各组大鼠定位航行训练运动轨迹比较

2.2 显微镜观察大鼠海马神经元结构 HE染色观察各组海马CA1区结果显示，对照组海马神经元细胞形态结构正常，核圆且大，锥体细胞带致密、整齐、均匀；酒精组海马锥体细胞带开始有细胞脱落，排列较松散，部分胞质深染；酒精+高脂饮食组海马神经元减少且形态异常，锥体细胞带排列松散且分布紊乱，胞质深染，见图2。

图2 各组大鼠海马组织CA1区HE染色（×200）

2.3 酒精及高脂饮食对大鼠海马TGF-β1水平的影响 TGF-β1在各组大鼠海马表达水平分别为对照组（2293.38±132.36）pg/ml、酒精组（2444.81±99.99）pg/ml、酒精+高脂饮食组（2690.02±81.16）pg/ml，与对照组相比，酒精+高脂饮食组TGF-β1水平显著增高，差异具有统计学意义（P=0.023）。

2.4 酒精及高脂饮食对大鼠海马P-Smad3、Smad4水平的影响 对照组、酒精组、酒精+高脂饮食组大鼠P-Smad3、Smad4表达逐渐增加，与对照组相比，酒精组、酒精+高脂饮食组大鼠P-Smad3、Smad4表达水平显著增加，差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 Western-blot检测各组大鼠海马组织P-Smad3、Smad4蛋白相对表达量（±S.E.M.）

表2 Western-blot检测各组大鼠海马组织P-Smad3、Smad4蛋白相对表达量（±S.E.M.）

注：与对照组比较，*P<0.05

组别 P-Smad3/β-actin Smad4/β-actin对照组 1.30±0.06 0.82±0.01酒精组 1.91±0.23* 1.36±0.71*酒精+高脂饮食组 2.46±0.15* 1.88±0.18*

3 讨论

在长期高脂饮食及酒精依赖的条件下，发生中枢神经元损伤及认知障碍已有报道。一项对来自14个不同研究的1 394例轻度认知障碍受试者的研究显示，其危险因素包括抑郁症、肥胖和高胆固醇血症等，酒精依赖尤为显著地增加了认知能力下降的风险[7]。与既往研究结果一致，在本次Morris水迷宫实验中，酒精组、酒精+高脂饮食组大鼠潜伏期均长于对照组，观察大鼠的运动轨迹可知，酒精组及酒精+高脂饮食组大鼠因记忆力受损，运动轨迹复杂、混乱，趋向性差，导致迟迟找不到平台，说明酒精及高脂饮食对大鼠的空间记忆能力、学习能力均产生了不利影响。

海马是与认知相关的重要脑区之一。一项关于痴呆患者危险因素与脑区结构的研究发现，酒精依赖与海马区灰质体积减少独立相关[8]，海马神经发生减少，严重影响认知能力。动物研究表明，喂食高脂饮食的啮齿类动物在体重增加之前的3～5天内，表现出海马依赖性学习和记忆能力受损[9]。目前公认的是神经发生经历了复杂的步骤，对大脑的动态平衡起着重要作用，同样在海马区中的干细胞需经历复杂过程分化为新的神经元细胞及其他脑细胞，为保持大脑认知功能起着关键作用，但是该过程要面临许多内在及外在因素的干扰，已证实高脂饮食及酒精摄入对神经发生具有显著的危害作用。一项荟萃分析集中观察了41项研究，发现高脂饮食增加海马炎症和海马神经发生减少，使个体面临更高的轻度认知损害风险，并且加速认知障碍疾病进程[10]。本研究中对照组海马神经元形态结构正常、排列紧密，酒精组和酒精+高脂饮食组海马神经元细胞均有不同程度的减少，且排列不规则、核质深染，表明随着酒精、高脂饮食的长期摄入，会造成海马神经细胞凋亡。本研究主要经HE染色观察酒精、高脂饮食对海马组织切片的变化，也可通过凋亡染色完成对海马组织凋亡情况的进一步研究。

目前，对于高脂饮食及酒精依赖造成认知障碍的机制研究较多，近年来多种研究表明，炎症反应在认知障碍的神经元损伤机制中作用比较突出。长期饮酒及高脂饮食会提高中枢神经和外周神经系统中的酒精浓度、胆固醇水平，破坏血脑屏障，导致海马炎症因子表达增加，影响学习及记忆功能[11]。TGF-β是一种多效性细胞因子，在神经胶质细胞活化、炎症和损伤后修复中起关键作用。大脑中的TGF-β在正常机体中具有抗炎作用，抑制小胶质细胞的激活。然而，TGF-β过度表达促进大脑炎症，同时促进星形胶质细胞在脑微血管周围聚集，加速脑血管β-淀粉样蛋白沉积，降低脑实质Aβ病理改变的同时，可引起相关区域血流灌注损伤，并诱导神经元Aβ分泌[12]。TGF-β/Smad信号通路被认为涉及多种生理和病理机制，这些机制与多种神经疾病有关，包括帕金森病、多发性硬化症和阿尔兹海默症，所以TGF-β/Smad通路与认知障碍相关疾病密切相关。机体遭受有害因素刺激或细胞外基质异动时，如酒精及高脂饮食，TGF-β明显活化，细胞表面TGF-β家族受体的功能复合物包括TGF-βI型（TGF-βRI）受体、TGF-βⅡ型（TGF-βRⅡ）受体、激活素受体样激酶5（ALK5），因此激活的TGF-βRⅠ磷酸化选定的Smad变成P-Smad2、P-Smad3，这些受体激活的Smad与Smad4形成复合体，易位到细胞核中，进一步调节涉及细胞增殖的各种靶基因的表达。在一项关于星形胶质细胞与阿尔兹海默症的病理机制研究中发现，淀粉样蛋白前体变性与TGF-β/Smad信号激活有关，促进星形胶质细胞增生、淀粉样斑块形成和认知障碍加重，表明TGF-β/Smad通路信号激活与认知功能损害和淀粉样斑块积聚有必然联系[13]。本研究中酒精组、酒精+高脂饮食组大鼠海马中TGF-β1、P-Smad3、Smad4表达增加，且与对照组相比，酒精组、酒精+高脂饮食组P-Smad3、Smad4表达显著增加，差异均具有统计学意义，证明酒精、高脂饮食对机体的损伤激活了TGF-β/Smad信号通路。

本研究给予大鼠酒精、酒精+高脂饮食喂养28d后，观察大鼠认知行为的改变及海马神经元变化，发现海马内炎症因子TGF-β1、P-Smad3、Smad4表达增加，学习记忆能力下降，可能与TGF-β/Smad通路激活造成大脑中β-淀粉样蛋白沉积和神经炎性斑块聚集有关。抑制外周及中枢神经组织中TGF-β/Smad通路相关异常因子可能是治疗痴呆的一种较好方法。