花椒黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性的研究

王和涛，刘罗罗

（1.青岛酒店管理职业技术学院基础教学部，山东 青岛 266100；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018）

花椒（Zanthoxylum bungeanum）是重要的香料和药用经济作物，为芸香科花椒属落叶小乔木［1，2］，在我国分布广泛，大多在海拔1 200 m以下山坡，主要产于贵州、云南、四川等省份［3－5］。目前已形成四川茂汉、贵州六盘水、云南曲靖等全国闻名的种植基地［6，7］。花椒除含有芳香油、多酚、糖苷、生物碱、蛋白质等多种活性成分外，还富含黄酮类化合物［8，9］。黄酮类化合物具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗病毒、防止动脉硬化、延缓衰老等药理活性［10－12］，已被广泛应用于药品、食品、化妆品等领域［13，14］。对花椒中黄酮进行提取并开发成多种类型的功能食品及其他高附加值产品，有助于实现花椒资源的高值化利用［15，16］。

超声波辅助提取法主要是利用其空化作用破坏植物细胞使提取物溶入提取液中，进而提高提取效率，是一种操作简单、便捷、能耗低的生物活性物质提取方法［17］。目前，关于黄酮提取工艺优化的研究报道较多：如杨爽等［18］采用正交试验法优化索氏提取薏米中黄酮；马俊鹏等［19］采用正交试验优选铁力木花蕾总黄酮提取工艺；米智等［20］采用正交试验优化苦荞黄酮提取工艺。然而，利用响应面法优化超声波辅助提取技术提高花椒中黄酮提取得率的研究还鲜见报道。因此，本试验采用超声波辅助法提取花椒中的黄酮，以乙醇浓度、料液比、提取温度及提取时间为考察因素，在单因素试验基础上，通过Box－Behnken响应面设计优化其最佳提取工艺，并对其体外抗氧化活性进行初步评价，旨在为花椒黄酮的高值化开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

花椒：市售，产地云南曲靖市，用研磨仪粉碎过80目筛后备用。

水为GB／T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定一级水；硝酸铝、乙酸钾、氢氧化钠等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）：济南润泰化工有限公司；芦丁标准品（纯度≥98.0%，生产批号：C100001）：北京瑞达恒辉科技发展有限公司；1，1－二苯基－2－苦肼基（1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH）、维生素C（纯度≥98.0%）：北京坛墨质检有限公司。

1.2 仪器与设备

CLN－24L低温组织研磨仪：上海净信实业发展有限公司；FA2204电子分析天平：上海衡平仪器仪表有限公司；UV－2601可见分光光度计：北京北分瑞利分析仪器（集团）公司；80目标准试验筛：上海过望化工有限公司；SCQ－1800F超声波提取仪：上海声彦超声波仪器有限公司；H2500R－2高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；WB－502S超级电热恒温水浴锅：广东环凯生物科技有限公司；OE－45电热鼓风干燥箱：中科瑞捷（天津）科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 花椒黄酮的提取 称取适量花椒粉末置于圆底烧瓶中，加入适量石油醚（60～90℃），回流萃取3次，旋转浓缩除去石油醚，残渣于60℃烘箱中干燥至恒重取出，于4℃冰箱中保存备用。

称取上述残渣样品2.0 g（精确至0.001 g）置于150 mL具塞三角瓶中，用75% ～95%的乙醇作为提取溶剂，按料液比1∶（10～30）g／mL加入提取溶剂，在提取温度为40～80℃条件下置于超声波提取仪中提取15～55 min，仪器工作频率为40 kHz；提取液以4 500 r／min离心10 min，取上清液；按照相同条件重复1次，合并提取液，用旋转蒸馏仪浓缩至1 mL，过C18SPE小柱进行脱色处理，用无水乙醇定容至50 mL，得到花椒黄酮的提取液，待测。

1.3.2 标准曲线的绘制 准确称取50 mg芦丁标准品于50 mL容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，并超声溶解，即得浓度为1.0 mg／mL贮备液，于4℃冰箱中储存备用。精密吸取芦丁贮备液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇至总体积为15 mL，然后依次加入质量浓度为100 g／L的硝酸铝溶液1 mL、98 g／L的乙酸钾溶液1 mL，摇匀后加水至刻度，再次摇匀，静置60 min，即得标准工作液，其质量浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mg／mL；用1 cm比色皿于420 nm处测其吸光度，以30%乙醇溶液为空白；以50 mL中芦丁质量（mg）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得y＝1.7879x＋0.06984，R2＝0.9999。

1.3.3 花椒黄酮的测定 精密吸取待测样品溶液1.0 mL，置于50 mL容量瓶中，按照1.3.2显色反应后测定吸光度，根据标准曲线计算花椒黄酮提取得率：

式中：X为黄酮类化合物的得率，%；m为经标准曲线求出的样品比色液中芦丁质量，mg；W 为样品的质量，g；d为稀释比例。

1.3.4 单因素试验 固定料液比1∶20 g／mL、提取温度70℃、时间35 min，考察不同乙醇浓度（75%、80%、85%、90%、95%）对花椒黄酮得率的影响；固定乙醇浓度85%、提取温度70℃、提取时间35 min，考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g／mL）对花椒黄酮得率的影响；固定乙醇浓度85%、料液比1∶20 g／mL、提取时间35 min，考察不同提取温度（40、50、60、70、80℃）对花椒黄酮得率的影响；固定乙醇浓度85%、料液比1∶20 g／mL、提取温度70℃，考察不同提取时间（15、25、35、45、55 min）对花椒黄酮得率的影响。

1.3.5 响应面优化试验 在单因素试验基础上，选取乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取温度（C）、提取时间（D）为自变量，以花椒黄酮得率（Y）为响应值，根据Box－Behnken试验原理［25］做四因素三水平曲面设计，应用Design－Expert 8.0.6进行数据分析及模型建立，对黄酮的提取工艺进行优化。试验设计因素、水平见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平

1.3.6 花椒黄酮体外抗氧化活性研究 DPPH自由基清除试验：根据已报道的方法［21，22］，用95%乙醇配制0.2 mmol／L的DPPH溶液，分别在10支10 mL离心管中加入1.0 mL不同浓度的样品提取液，再分别加入DPPH溶液4 mL，充分摇匀，于黑暗环境中反应30 min，在517 nm处测定其吸光度。以相同质量浓度的L－抗坏血酸（VC）作为阳性对照，用以下公式计算DPPH自由基清除率：

式中：SDPPH为DPPH自由基清除率，%；A0为1 mL蒸馏水＋4 mL DPPH溶液的吸光度；Ai为1 mL样品＋4 mL DPPH溶液的吸光度；Aj为1 mL样品＋4 mL无水乙醇的吸光度。

花椒黄酮对羟基自由基的清除能力：根据文献方法［23，24］，分别在10支10 mL离心管中分别加入1.0 mL不同浓度的样品提取液，再分别依次加入6 mmol／L的FeSO42.0 mL和6 mmol／L的水杨酸2.0 mL，混匀后再加入6 mmol／L的H2O22.0 mL启动Fetion反应，35～40℃恒温水浴35 min，静置15 min后于510 nm处测定其吸光度。以相同质量浓度的L－抗坏血酸（VC）作为阳性对照，用以下公式计算羟基自由基清除率：

式中：S羟为羟基自由基清除率，%；Ae为空白组吸光度；Ax为样品组吸光度；As为去离子水代替H2O2测得的对照组吸光度。

1.4 数据处理

每组试验平行测定3次，使用Microsoft office 2016制图，应用Design－Expert 8.0.6进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 花椒总黄酮提取工艺单因素试验结果分析

由图1结合表2分析可知，花椒黄酮提取得率随着乙醇浓度的增加呈现先增大后降低的趋势，当乙醇浓度为85%时达到最大值。原因可能是乙醇浓度为85%时，花椒黄酮的溶出趋于饱和；随着乙醇浓度的继续增加，花椒中其他脂溶性物质、醇溶性色素溶出增多，这些成分会与花椒黄酮类化合物竞争乙醇－水分子结合体，从而使得花椒黄酮得率降低。因此选择80%、85%、90%乙醇浓度进行响应面优化试验。

表2 黄酮提取工艺因素水平

图1 单因素对黄酮得率的影响

料液比1∶（10～20）g／mL范围内，随着乙醇比例增加花椒黄酮提取得率急剧增加。其原因可能是随着乙醇比例的增大，花椒样品与提取溶剂的接触面积增大，这有利于花椒黄酮的溶出；随着乙醇比例继续增加，花椒黄酮提取得率趋于平缓，不仅会造成其他杂质溶出，还会增加提取成本。因此选择料液比1∶15、1∶20、1∶25 g／mL进行响应面优化试验。

花椒黄酮的提取得率随着提取温度的升高呈先增大后降低的趋势，70℃时达到最大值。其原因可能是在一定的范围内提高提取温度能降低提取溶剂与样品的粘稠度，增加花椒黄酮在提取溶剂中的扩散性和溶解度，有利于花椒黄酮溶出从而使提取得率升高。当提取温度过高时，高温会造成花椒黄酮的破坏，从而使其提取得率降低。因此选择提取温度60、70、80℃进行响应面优化试验。

花椒黄酮提取得率随着提取时间的延长呈先增加后降低趋势，并在35 min时达到最大值。这表明提取时间为35 min时，花椒黄酮已趋于完全溶入提取溶剂中，继续延长提取时间反而会使花椒黄酮长时间处于高温浸泡中，导致其分子结构破坏，同时伴随花椒中其他杂质的溶出，花椒黄酮提取得率下降。因此选择提取时间25、35、45 min进行响应面优化试验。

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 回归模型的建立及分析 在单因素试验基础上，选用响应面法对花椒黄酮的提取工艺进行优化，结果见表3。对表3中数据进行回归分析，得回归方程为Y＝56.18＋0.37A－0.21B－0.74C＋0.59D＋0.64AB－0.51AC＋0.47AD＋0.57BC－0.78BD＋0.37CD－0.69A2＋1.01B2－0.88C2＋1.87D2。

表3 Box－Behnken试验设计及响应值

由表4可知，P模型<0.0001，表明回归模型具有高度显著性；P失拟项＝0.836＞0.05，说明模型构建成功，试验以外的其他因素对黄酮提取得率影响较小；判定系数R2＝0.987，表明回归方程的拟合度较好。根据F值的大小可知，4个试验因素对黄酮得率的影响表现为提取温度（C）＞乙醇浓度（A）＞提取时间（D）＞料液比（B）。其中，一次项A、C和二次项D2对黄酮得率的影响极显著（P<0.01），一次项D和二次项A2及交互项AB、AC对黄酮得率的影响显著（P<0.05），其余项影响不显著。

表4 回归模型的方差分析

2.2.2 响应面交互作用分析 为评价两因素交互作用对黄酮得率的影响并确定各因素的最佳水平范围，分别绘制4因素两两交互的响应曲面图，如图2所示。曲面走势越陡峭，表明两因素交互作用对响应值的影响越显著［25］。可以看出，乙醇浓度与料液比、乙醇浓度与提取温度的交互作用显著，表现为响应曲面走势陡峭。

图2 两两因素交互作用对花椒黄酮得率的影响

2.3 最佳提取工艺的确定与验证

应用Design－Expert 8.0.6软件求解二次回归方程可得花椒黄酮提取最优工艺参数：乙醇浓度为85.24%，料液比为1∶19.89 g／mL，提取温度为71.12℃，提取时间为35.15 min，预测花椒黄酮的提取得率为11.98%。考虑到实际提取工作中的操作可行性，将工艺参数修正为：乙醇浓度85%，料液比1∶20 g／mL，提取温度70℃，提取时间35 min。在此条件下进行验证试验，花椒黄酮的实际提取得率为12.16%，该值与预测值基本相符，表明确定的黄酮提取工艺准确有效。

2.4 抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH是一种以氮为中心非常稳定的自由基，在517 nm处具有较强的吸光度，通常用于检测样品的抗氧化能力。由图3可知，花椒黄酮质量浓度在0.01～1.0 mg／mL范围内对DPPH自由基的清除率随着浓度的增加呈上升趋势。0.2 mg／mL时，花椒黄酮对DPPH自由基的清除率为55.12%，该浓度下VC对DPPH自由基的清除率为80.65%，相同质量浓度下VC对DPPH自由基的清除效果明显优于花椒黄酮。经Graphpad Prism 7计算得花椒黄酮和抗坏血酸对DPPH自由基的半数清除率即IC50值分别为0.0819、0.0315 mg／mL。可见，花椒黄酮对DPPH自由基具有一定的清除能力，但与VC相比能力较弱，可作为天然抗氧化剂应用。

图3 花椒黄酮粗提物对DPPH自由基的清除能力

2.4.2 羟基自由基清除能力 通过Fenton体系产生的羟基自由基与水杨酸混合后的产物在510 nm处有特殊吸收，加入自由基清除剂后，羟基自由基减少，与水杨酸的产物减少，吸光度降低。由图4可知，花椒黄酮质量浓度在0.01～1.0 mg／mL范围内对羟基自由基的清除率随着浓度的增加呈上升趋势。0.2 mg／mL时，花椒黄酮对羟基自由基的清除率为56.38%，而VC对羟基自由基的清除率为85.65%，清除效果明显优于花椒黄酮。经计算得花椒黄酮和抗坏血酸对羟基自由基的半数清除率即IC50值分别为0.0376、0.0265 mg／mL。说明花椒黄酮提取物对羟基自由基具有一定清除能力。

图4 花椒黄酮粗提物对羟基自由基的清除能力

3 结论

本研究采用超声波辅助提取花椒中黄酮成分，并在单因素试验基础上，采用响应面法对提取工艺进行优化，考察乙醇浓度、料液比、提取温度及提取时间对花椒黄酮提取得率的影响。结果表明，由响应面分析得到的二次模型拟合度较高，影响花椒黄酮提取得率的因素表现为提取温度＞乙醇浓度＞提取时间＞料液比；最佳提取工艺为乙醇浓度85%、料液比1∶20 g／mL、提取温度70℃、提取时间35 min。在此条件下进行验证试验，花椒黄酮的实际提取得率为12.16%，与预测值11.98%基本相符，说明所得花椒黄酮提取工艺可靠有效，具有实际应用价值。

体外抗氧化活性研究表明，花椒黄酮对DPPH自由基和羟基自由基具有一定清除能力，其IC50值分别为0.0819、0.0376 mg／mL。尽管花椒黄酮的抗氧化活性远低于L－抗坏血酸，但在一定浓度下花椒黄酮具有抑制自由基生成的作用，因此，花椒黄酮粗提物有望开发为天然抗氧化剂。后续将进一步分离鉴定花椒黄酮粗提物，为花椒黄酮的综合开发与利用提供理论支撑。