牦牛骨脂质组成及其理化性质分析

梁云霞，谢素雅，李红波, ，张小勇，徐 丹，莫海珍，刘振彬，胡梁斌,

（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安 710021；2.中粮工科（西安）国际工程有限公司，陕西西安 710082）

牦牛是一种耐低温、耐力强的珍稀畜种资源，主要生活在我国青藏高原等空气稀薄的高海拔地区。牦牛是唯一能在青藏高原及其毗邻的高寒牧区繁衍的牛亚科动物，有“高原之舟”和“全能家畜”的美誉[1−2]。我国是世界上牦牛饲养最多的国家。据统计，根据国家肉牛牦牛产业技术体系测算，2020 年，全国屠宰肉牛头数约2920 万头，胴体总产量约为740 万t，净肉产量约637 万t[3]。牦牛骨作为牦牛肉加工过程中产生的主要副产物，其营养丰富，含有丰富的胶原蛋白、多肽、多糖和脂肪等营养物质[4−5]。

而牦牛骨作为可食性副产物未被有效利用。其中多肽和多糖综合利用程度较高[6−8]，近年来对牦牛骨的利用多集中在制备骨汤、骨粉、骨肽、硫酸软骨素多糖等提取制备及微量元素上[9−12],但对其脂肪酸的研究鲜见报道[13−14]。脂肪酸作为骨代谢中不可缺少的成分，对维持骨健康具有重要的作用[15−16]。脂肪酸与骨代谢和相关的骨疾病密切相关，例如脂肪酸可降低心血管等疾病的风险，脂肪酸是治疗和预防代谢性骨病的潜在治疗剂和营养剂[17−20]。而在牦牛骨加工中，工艺上脱脂是第一道工序，脂肪作为畜禽骨加工产业中的废弃物和污染物，常常被丢弃。本文通过提取牦牛骨中的脂质，测定其理化性质，分析其脂质组成，为提高牦牛骨的利用率，实现高值化利用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牦牛骨（牦牛腿骨） 源自于食品公司生产所用废料；Car 标准品（纯度≥99.9%）、SM 标准品（纯度≥99.9%）、PC 标准品（纯度≥99.9%）和TAG 标准品（纯度≥99.9%） 均购自美国Avanti 公司；2,6-二叔丁基对甲酚、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、正己烷、异丙醇、乙腈、酚酞 上海麦克林生化有限公司；1%硫酸甲醇溶液、饱和NaCl 溶液、0.1%甲酸、0.01 mol/L 乙酸铵、铬酸洗液、三氯甲烷乙酸混合溶液、1%淀粉指示剂、0.1 mol/L 硫代硫酸钠标准溶液、碘化钾饱和溶液、氢氧化钾、盐酸标准滴定溶液等 均为实验室配制溶液；所有有机溶剂均为国产分析纯。

Agilent 7000D 三重四极杆GC/MS 仪 安捷伦科技（中国）有限公司；TSQ Quantiva 三四极质谱仪赛默飞世尔科技有限公司；LC-2800 RoHS2.0 高效液相色谱仪（HPLC） 佛山市捷特精密仪器有限公司；RE100-Pro 型旋转蒸发仪 大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；892 型油脂氧化稳定分析仪 瑞士万通中国有限公司；FS 3310 型真空抽滤器 郑州市亚荣仪器有限公司；MD 200-1 型氮吹仪 杭州奥盛仪器有限公司；KQ5200DE 型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；FW-100 D 型高速万能碎骨机 天津鑫博得仪器有限公司；JA 2003 N 型分析天平 上海佑科仪器仪表有限公司；HH-W 21-600型恒温水浴锅 郑州南北仪器设备有限公司；纳米喷流离子源 艾德威尔生物科学股份公司；SHB-III 型循环水式多用真空泵 辽宁赛亚斯科技有限公司；VRD-8 型双级旋片式真空泵 辽宁赛亚斯科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 将牦牛腿骨剔除表面的肉等杂质，粉碎成粒径1 mm 的颗粒状待用。

1.2.2 油脂提取 油脂的提取按照Folch 的方法[21]稍作修改。样品粉碎之后称重，按照样品：溶剂为1:10 或1:15（根据样品的量进行调节），溶剂（氯仿:甲醇:水=2:1:0.75），加入0.005%的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）抗氧化，30 ℃，500 W 超声波辅助萃取20 min，真空抽滤后分液收集下层，弃去上层，下层旋转蒸发除去有机溶剂得到油脂，每个样品重复三次萃取，旋蒸后还残存的有机溶剂可用氮吹法除去，得到的油脂装样后低温保存测样。

1.2.3 脂肪酸甲酯化 取20 μL 1.2.2 的样品至试管中，加入1.5 mL 的1%硫酸甲醇溶液，80 ℃水浴1 h并且不时摇晃，水浴后加入1 mL 饱和NaCl 溶液，1 mL 去离子水，2 mL 色谱纯正己烷，静置分层后收集上层有机相低温保存−20 ℃下进行质谱分析。

1.2.4 脂质分析 在本研究中使用三四极质谱仪，配备了自动纳米喷流离子源，并在Xcalibur 系统软件下运行，根据脂质组学原理[22]，采用多维质谱鸟枪法脂质组学（MDMS-SL）对不同种类和个体的脂质进行鉴定和定量[23−24]。

FAMEs（脂肪酸甲酯）的分析采用GC-MS 系统（Agilent 7000 D 三重四极杆 GC/MS），配以安捷伦DB-23 色谱柱（30 mm×0.25 mm 内径，0.25 μm 膜厚）。在全扫描模式下（m/z 50～500），所有测量都使用以下程序进行：初始温度130 ℃保持1 min，然后升高到230 ℃，坡度为5 ℃/min。最终温度230 ℃维持5 min，总运行时间为26 min。将1.2.3 脂肪酸甲酯化后的样品与0.01 mmol/mL 标准品（Car、SM、PC 和TAG）溶液按照10:1 的比例混合后吸取1 μL 进样，通过自动进样器在1:20 的分裂模式下进行，将质谱所得原始数据用Xcalibur 软件处理，并用内标法来进行定性和定量。

1.2.5 物理化学指标测定 用IUPAC 法（2.101、2.102、2.202、2.501）[25]分别测定牦牛骨油脂的密度、折射率、皂化值和过氧化值。油的颜色根据AOCS官方方法[26]测定。碘值、酸价、熔点采用GB/T 5532-2008、GB/T 5009.229-2016 和GB/T 12766-2008 来进行测定。

1.2.6 生育酚成分的测定 油中的生育酚（α-生育酚、α-三烯酚、γ-三烯酚）含量根据以前的报告[27]进行了一些修改。采用HPLC 高效液相色谱和荧光检测器进行分析：色谱柱Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为正己烷/异丙醚（99/1，v/v）；流速0.7 mL/min；柱温设置为40 ℃，激发发射波长分别设置在298 和325 nm。将油以30 mg/mL 溶解于正己烷中，用正己烷/异丙醚（99/1，v/v）以0.8 mL/min溶剂洗脱，进样量20 μL。按照标准曲线测定生育酚的绝对含量：α-生育酚、α-三烯酚、γ-三烯酚在0.015～1.7 μg 与对应的峰面积作图，呈良好的线性关系，相关系数在0.9993～0.9998 之间，最低检测限（3 倍噪音S/N）3.5×10−5μg/g。

1.2.7 油脂氧化稳定性的测定 油的氧化稳定性根据报道的方法[28]用油脂氧化稳定分析仪进行测定；油（5 g）在110 ℃（空气流量20 L/h）下氧化，感应时间自动记录。

1.3 数据分析

本实验所有数据均重复三次，数据运用利用EXCEL 2003、Origin 8.5 来绘制图形，SPSS 软件进行方差及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 牦牛骨脂质的脂肪酸组成

对牦牛骨脂质进行GC-MS 分析，结果如表1 所示。牦牛骨中检出20 种脂肪酸，远远高于文献所报道的羊骨和鸡骨的脂肪酸种类的7 种和17 种[29−30]。牦牛骨脂质脂肪酸种类丰富，其中包括癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、接骨木酸等。其C 原子主要在11～21 之间。牦牛骨脂质不但含有驴骨骨油中所缺少的亚油酸，脂肪酸种类也比驴骨骨油多[31]，而且还有鸡骨和羊骨[29−30]中没有的癸酸，且癸酸含量为0.07%。研究显示，癸酸在体内起中性作用，它们会增加胆固醇的浓度，但同时也会调节LDL（低密度脂蛋白）代谢[32]。相关研究表明，脂肪酸与人体健康息息相关，不饱和脂肪酸不但具有抑制血栓形成、降低血脂、防止心肌缺血、抑制动脉粥样硬化等作用，而且对心脑血管疾病防治、抗癌、降胆固醇、促生长因子、免疫调节和防治糖尿病有积极作用。除此之外，脂肪酸对骨骼生长发育有促进的作用[33]。研究表明，n-3 PUFAs 与儿童的生长发育密切相关，PUFA 在骨质疏松方面对骨健康存在重要影响，多不饱和脂肪酸（如花生四烯酸）可以通过AA（含氮化合物）代谢通路促进骨折愈合[34−35]。

牦牛骨脂质脂肪酸中，SFA（饱和脂肪酸）含量占脂肪酸总量的41.75%。FA n:1（单不饱和脂肪酸）为53.01%，PUFA（多不饱和脂肪酸）1.46%，其他为3.79%。其中，饱和脂肪酸有癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、月桂酸、硬脂酸、花生酸等，不饱和脂肪酸有油酸、棕榈酸等。饱和脂肪酸中，硬脂酸含量较高，为18.51%，其含量高于羊骨油中的硬脂酸含量15.6%[29]。不饱和脂肪酸中，棕榈酸和油酸含量较高，分别为20.38%和49.02%，且有研究显示棕榈酸酯对促进婴幼儿体内脂肪酸和矿物类营养物质的吸收，提高骨骼生长速度及骨矿物质含量及密度，促进肠道益生菌的生长，减少婴儿啼哭，促进大脑发育方面有积极作用[36]。因此，牦牛骨脂质脂肪酸对维持骨健康具有重要的作用。

2.2 牦牛骨脂质组学定量分析结果

对牦牛骨脂质进行脂质组学分析，从表2～表5可以看出在负离子模式下，牦牛骨油脂中共检测出4 种脂质：Car（乙酰左旋肉碱）、SM（鞘磷脂）、PC（磷脂酰胆碱）、TAG（三脂酰甘油及中性脂肪）。其中Car 19 种、SM 17 种、PC 36 种、TAG 39 种。Car 主要集中在m/z 368～512 区域，SM 主要集中在m/z 681～821 区域，PC 主要集中在m/z 710～846 区域，TAG 主要集中在m/z 807～919 区域。从表中可以看出，牦牛骨脂质中Car（18:0）、SM（N-16:0）、PC（D-16:0/18:1）、TAG（C52:2/C53:9）含量最高。其中Car 和SM 是两种磷脂，他们的2 条脂肪酸链sn-1/sn-2 位多数由18:0 和18:1 组成，所有的脂肪酰基链有14～24 个碳，每个链上有0～5 个双键。从图1 可以看出Car（乙酰左旋肉碱）、SM（鞘磷脂）、PC（磷脂酰胆碱）、TAG（三脂酰甘油及中性脂肪）的含量分别为1.47、51.59、70.16 nmol/g 和31.13 nmol/g 。这四种含量最高的是PC，其次是SM、TAG 和Car。

表2 乙酰左旋肉碱分子种类、质荷比、含量Table 2 Car molecular species,mass-to-charge ratio and content

表3 鞘磷脂分子种类、质荷比、含量Table 3 SM molecular species,mass-to-charge ratio and content

表4 磷脂酰胆碱分子种类、质荷比、含量Table 4 PC molecules species,mass-to-charge ratio and content

表5 甘油三酯及中性脂肪分子种类、质荷比、含量Table 5 TAG molecular species,mass-to-charge ratio and content

图1 牦牛骨脂质Car、SM、PC、TAG 的含量Fig.1 The content of Car,SM,PC,TAG in yak bone lipid

2.3 理化指标的测定

牦牛骨的理化指标结果见表6。用IUPAC 法测定了牦牛腿骨的理化指标，结果表明：牦牛腿骨的皂化值191.56 mg KOH/g，在185～200 mg KOH/g的范围之内，说明牦牛腿骨的脂肪酸在C16～C18 的范围内。从氧化稳定性和酸价来看，牦牛腿骨的酸价为2.03 mg KOH/g，说明腿骨的油脂的脂肪酸稳定性较好。而牦牛腿骨的碘值为26.45 g/100 g，说明牦牛腿骨的不饱和脂肪酸较多。牦牛腿骨的熔点较高，过氧化值和折射率分别为5.26 mmol/kg 和1.4253%，由于油脂色泽过暗，未能检出，需要进一步精炼。

表6 牦牛骨理化性质Table 6 Physical and chemical properties of yak bone

2.4 牦牛骨油脂中的酚类化合物

牦牛骨油脂的酚类化合物含量见表7。从牦牛腿骨中检出了两种VE成分：α-三烯酚和γ-三烯酚，其含量分别为1.75 μg/g 和3.6 μg/g。已有研究表明，生育三烯酚可通过激活Wnt/β-catenin 信号减少激素诱导骨质疏松大鼠骨量流失，提高骨密度、骨微观结构和骨强度[37]。生育酚可治疗骨坏死，对骨健康有益[38]。

表7 牦牛骨油脂中酚类化合物的含量Table 7 Content of phenolic compounds in yak bone grease

2.5 油脂的氧化稳定性

油脂氧化受氧、水、光、热、微生物等作用，会逐渐水解或氧化而变质酸败，使中性脂肪分解为甘油和脂肪酸，或使脂肪酸中不饱和链断开形成过氧化物，再次分解而产生有害物质。通过测定诱导时间的长短可以了解油脂氧化稳定性的大小，诱导期越长表明油脂氧化稳定性好，反之，油脂氧化稳定性越差。油脂的氧化曲线如图2 所示，牦牛骨油脂的诱导时间为5.56 h。孙曙庆[39]研究的在110 ℃下猪油的诱导时间为2.5 h，花生油、菜籽油和大豆油的氧化诱导时间分别为4.0、3.7 h 和3.5 h。而牦牛骨的氧化诱导时间明显高于这些动物油脂和植物油脂。因此，牦牛骨的油脂氧化稳定性比较好，具有较好的抗氧化效果。

图2 油脂氧化曲线Fig.2 Oil oxidation curve

3 结论

本实验对牦牛腿骨脂质进行提取，利用GCMS 进行脂质组学分析并测定其理化指标。脂质组学分析显示，共检出20 种脂肪酸，其中SFA（饱和脂肪酸）含量占脂肪酸总量的41.75%，FA n:1 为53.01%，PUFA 1.46%，其他为3.79%。在负离子模式下共检测出4 种脂质：Car、SM、PC 和TAG，其中Car 19 种、SM 17 种、PC 36 种、TAG 39 种。这四种含量依次是PC＞SM＞TAG＞Car。

理化指标结果表明，牦牛腿骨的脂肪酸在C16～C18的范围内，油脂的脂肪酸氧化诱导时间为5.56 h，稳定性较高、抗氧化效果较强且不饱和脂肪酸较多。由于油脂色泽过暗，未能检出。从牦牛腿骨中检出了两种物质：α-三烯酚和γ-三烯酚。牦牛骨脂肪中脂肪酸含量丰富，其含有其他动物骨中所没有的癸酸，还有骨健康有益的棕榈酸等。而脂肪酸被认为可以维持骨健康，因此，牦牛骨中的脂质可以作为维护骨健康的营养补充剂，从而为实现其高值化利用打下基础。