米蛋白-海藻酸钠互穿网络水凝胶的制备及性能表征

苏 丹，杨 杨，范 婧，边 鑫，王 冰，刘琳琳，张铁男，马春敏，张 娜

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨 150028）

大米是许多国家的主食，占世界粮食能源供应的20%[1]，碎米是指在快速干燥、过度干燥等过程产生裂纹，从而导致研磨过程中破碎了的米粒，其长度尺寸小于全谷物的¾[2]。与精米或二等精米相比，碎米的价格更为低廉[3]。碎米中约含有8%～10%的蛋白质，米蛋白营养价值丰富，其赖氨酸含量为3%～4%，是谷物蛋白质中含量最高的蛋白质之一[2]。大米也因低致敏性的特点而受到人们的广泛关注。碎米蛋白在食品加工（如米豆腐）中最重要的功能特性之一是其加热时的凝胶特性，这显著影响产品的质构和感官特性。然而，天然碎米蛋白的胶凝性能非常差，并且通常易受加工条件的影响。因此，为了提高碎米蛋白在食品加工中的应用，有必要改善其凝胶特性。据报道，与其他成分（如脂肪、淀粉、多糖、水胶体和其他非蛋白质添加剂）的相互作用是提高蛋白质凝胶特性的有效方法[4]。海藻酸钠（SA）是一种由α-L-葡萄糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸通过随机排列连接而成的高分子多糖[5]，常被用于制备食品凝胶，而广泛应用于食品和生物医学领域[6]。Ca2+与SA 的α-L-古洛糖醛酸钠（G 块）交联形成“蛋盒”结构，从而形成凝胶网络[7−8]。Sun 等[9]也提出通过离子交联海藻酸钠可形成力学性能较高的水凝胶。

水凝胶是一类具有三维亲水网络结构的材料，由亲水性的交联聚合物链制成[10]。有研究提出，具有较高力学性能的食品级硬水凝胶更适于应对人造肉制品、可食用包装膜的挑战，并具有延长胃驻留药物的潜力[11−12]。因此，为拓展水凝胶在食品领域中的应用，关于增强水凝胶力学性能的方法研究具有较大意义。近年来，互穿聚合物网络（IPN）水凝胶作为增强生物聚合物凝胶的力学性能的新手段引起了研究者的广泛关注。IPN 是由两个或多个网络组成的聚合物，这些网络在分子尺度上至少部分交错，但彼此之间不共价键合[13−14]。可食用的IPN 水凝胶通常使用天然多糖和/或蛋白质制备。Wen 等[15]采用酶和离子交联的方法制备了明胶-海藻酸盐互穿聚合物网络（IPN）结构的新型生物聚合物水凝胶，利用流变和力学试验发现IPN 水凝胶的力学性能有显著提高。Wang 等[16]通过热处理和漆酶诱导制备了米谷蛋白-甜菜果胶形成复合凝胶，发现IPN 水凝胶比单纯的米谷蛋白具有更高的的流变性、结构性能和保水能力。因此，与单一材料水凝胶相比，复合材料制备的IPN 水凝胶表现出更高的凝胶强度和物理稳定性[14]。

因此，在本研究中，Ca2+离子交联SA 网络被用作IPN 水凝胶中的刚性网络，将碎米蛋白进行热处理，蛋白热聚集形成柔性网络，以增强力学性能。通过热处理和离子交联法制备具有互穿网络结构的高机械强度RP-SA IPN 水凝胶，考察了RP 浓度对水凝胶质构性能、流变性能、溶胀性能等特性的影响。以期为后续更多的高力学性能食品级水凝胶制备及应用开发提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

碎米 黑龙江省五常金禾米业有限公司；海藻酸钠、氯化钙 食品级，河南糖柜食品有限公司（中国河南）；其他试剂均为分析纯。

JA2003N 电子分析天平 上海佑科仪器仪表有限公司；HH-4D 数显恒温水浴锅 上海力辰邦西仪器科技有限公司；SHA-GS 双功能水浴恒温振荡器杭州旌斐仪器科技有限公司；H-PTD20 流变仪 奥地利安东帕有限公司；NMI20 核磁共振成像仪 上海纽曼电子科技有限公司；SCIENTZ-12N 冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；IsensoTA new pluse 质构仪 上海瑞芬国际贸易有限公司；JXFM110锤式旋风磨 上海嘉定粮油仪器有限公司；CM-700D 色差仪 日本柯尼卡美能达。

1.2 实验方法

1.2.1 碎米蛋白的提取 参考赵卿宇等[17]的方法，并稍作修改。将碎米进行打磨粉碎，过80 目筛，得到碎米粉。将所得碎米粉以1:4（g/mL）的料液比加入正己烷，室温下以170 r/min 振荡4 h，静置1 h，除去上清液，风干后得到脱脂米粉。

取一定量的脱脂米粉，以1:10（g/mL）的料液比添加蒸馏水，搅拌2 h，于4000 r/min 下离心15 min，收集沉淀，重复上述操作1 次。将收集的上清液用2 mol/L HCl 调至pH4.6，静置沉淀1 h 后，于4000 r/min下离心15 min，蒸馏水清洗沉淀3 遍，调至pH7.0，将所得碎米蛋白沉淀冷冻干燥，备用。

1.2.2 米蛋白-海藻酸钠IPN 水凝胶的制备 参考Niu 等[8]的方法制备水凝胶，并稍作修改。将一定量的碎米蛋白粉溶于去离子水中，pH 调节至9.0，搅拌过夜，以确保蛋白质完全溶解，从而获得80、100、120、140、160 mg/mL 的米蛋白储备溶液。取10 mL 相应的米蛋白溶液于50 mL 烧杯中，随后加入一定量的海藻酸钠粉末，于50 ℃下搅拌溶解，使得最终获得的混合溶液中海藻酸钠最终浓度为15 mg/mL。将混合溶液于90 ℃加热30 min，将等体积10 mL的氯化钙溶液（1%（w/v））加入到热处理后的溶胶中，170 r/min 室温振荡4 h，用去离子水洗去未交联的钙离子，制备的水凝胶在4 ℃的冰箱中保存24 h，以便进一步测定。

1.2.3 色差的测定 水凝胶的色差参考Niu 等[18]的方法进行测定。使用色差仪对制备的水凝胶进行拍照测定，记录L*（亮度）、a*（红色）和b*（黄色），根据以下公式计算水凝胶的白度。

1.2.4 凝胶硬度的测定 水凝胶的凝胶硬度参考Wu 等[19]的方法测定。使用P0.5 探头，压缩比为50%，测前、测试及测后速率均为1.0 mm/s，触发力5.0 g，两次测定时间间隔为3 s，每个处理组重复3 次。

1.2.5 流变特性的测定 水凝胶的动态流变特性测定参考Zhong 等[20]的方法。使用型号为PP50 的平板进行测量，将水凝胶放置在流变仪板之间，首先进行应变相关测量以获得RP-SA IPN 水凝胶的线性粘弹性区域。应变相关测量后，进行频率相关测量。然后在小的恒定应变（1.0%）下测量动态流变特性，该应变在所有样品的线性区域内，在25 ℃下进行了从0.1～10 Hz 的动态频率扫描，将储能模量（G'）和损耗模量（G''）记录为频率的函数。

1.2.6 溶胀性的测定 参照任艳艳[21]的方法对冻干后的水凝胶样品溶胀性进行测定。溶胀试验在25 ℃下进行，将每个已知重量的冻干样品浸在去离子水中，直到达到绝对水合作用。每次取样时，取出凝胶样品，吸附表面液后记录。溶胀率（swelling ratio，SR）的计算公式如下：

式中：m2水凝胶冷冻干燥切块后的重量，g；m1水凝胶浸泡后并吸干表面多余液体后的重量，g。

1.2.7 低场核磁（LF-NMR）的测定 水凝胶水分分布的测定参考余永名等[22]的方法。采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脉冲序列进行自旋-自旋弛豫时间（T2）的测定，将制备好的水凝胶装入核磁测试管中，置于永久磁场射频线圈的中心进行核磁分析。并进行磁共振成像，伪彩图分析，样品的颜色从蓝色到黄色再到红色代表水分含量的逐步递增。

1.3 数据处理

每组实验重复3 次，使用Origin 2018 软件进行分析和绘图。采用SPSS 20 软件对实验数据进行单因素方差分析，以P＜0.05 为显著性差异，结果用平均值±标准差（D）表示。

2 结果与分析

2.1 RP-SA IPN 水凝胶的外观形态及色差比较

研究碎米蛋白的浓度分别为80、100、120、140、160 mg/mL 的条件下，RP-SA IPN 水凝胶的宏观形成。由图1 可以看出，在碎米蛋白浓度为80 mg/mL时RP-SA IPN 水凝胶表面不均匀，但随着碎米的蛋白浓度的增加，凝胶表面变得平滑，160 mg/mL 浓度下的RP-SA IPN 水凝胶质地更为坚硬且具有弹性。这是由于随着米蛋白浓度的增加，参与反应的物质会越来越多，因此形成的交联网络也会增加，凝胶内部结构变得致密，这些说明了水凝胶的外观形态的差异。

图1 不同碎米蛋白浓度下的RP-SA IPN 水凝胶的凝胶形态Fig.1 Gel morphology of RP-SA IPN hydrogels at different broken rice protein concentrations

颜色是决定产品应用和消费者可接受性的重要因素，也是解释凝胶形态的重要参数，因此，考察了RP-SA IPN 水凝胶样品的L*、a*、b*和白度值。其中，L*一般指明度指数，a*和b*决定样品颜色的色调和饱和度，白度值与光在水凝胶中的散色有关，RPSA IPN 水凝胶的白度值主要取决于凝胶网络中蛋白和/或聚合程度以及其表面的光学特性[22]。

RP-SA IPN 水凝胶的白度呈现在图2B 中，米谷蛋白浓度为160 mg/mL 时的RP-SA IPN 水凝白度最高为76.45，米谷蛋白的加入对RP-SA IPN 水凝胶的外观形态虽然有一定的影响，但影响较弱，随着RP 浓度的逐渐增高，白度变化幅度较小，但蛋白浓度为160 mg/mL 时的水凝胶白度值较80 mg/mL 浓度下的水凝胶白度值有较显著的提高（P＜0.05）。一方面，这可能是高浓度的碎米蛋白溶液在碱性环境与加热条件下呈现乳白色导致的。另一方面，水凝胶白度变化主要与水凝胶内部网络交联和键的形成有关，在协同作用条件下水凝胶形成致密结构[23]。在聚合物链之间形成大量的接合区，这可能会产生散射光的晶体区域[24]。但当凝胶网络形成较少的交联和较少的填充系统时，光散射能力降低[23]。因此，高浓度碎米蛋白的RP-SA IPN 水凝胶的凝胶网络更加致密，能反射更多的光从而使得白度增加，这也与Kang 等[25]的研究结果相似。

图2 不同碎米蛋白浓度对RP-SA IPN 水凝胶色差的影响Fig.2 Effect of different broken rice protein concentrations on chromat difference of RP-SA IPN hydrogels

2.2 RP-SA IPN 水凝胶的凝胶硬度

水凝胶的凝胶硬度是用来衡量水凝胶力学性能的常用手段，它表示完成形变所需要的力的大小。由图3 可以看出，米蛋白浓度可显著影响RP-SA IPN 水凝胶的凝胶硬度（P＜0.05）。Ca2+离子交联SA 形成的凝胶网络被用作IPN 水凝胶中的刚性网络，碎米蛋白在热处理后，蛋白发生热聚集而形成的凝胶网络作为柔性网络，从而增强了水凝胶的凝胶强度，因此，在80 mg/mL 的碎米蛋白浓度下就有较大的凝胶硬度（958.48 gf）。随着碎米蛋白的浓度的增大，水凝胶的硬度也逐渐增加，并在140 mg/mL 的碎米蛋白浓度后，水凝胶的硬度增加趋势变得较为平缓。这可能是由于含高浓度蛋白的混合溶液中分子间碰撞交联的几率逐渐增加，发生了更多的互连，形成了更多的凝胶网络结点和更精细的结构，稳定性更强，凝胶硬度更大[26]。另一个可能的原因是随着碎米蛋白的增加，碎米蛋白和海藻酸钠之间的静电相互作用增加，导致耦合网络的密度增加，从而使RG-IPN 水凝胶凝胶硬度增大，力学性能增强[27]。

图3 不同碎米蛋白浓度对RP-SA IPN 水凝胶凝胶硬度的影响Fig.3 Effect of different broken rice protein concentrations on gel hardness of RP-SA IPN hydrogels

2.3 RP-SA IPN 水凝胶的流变特性

在现有水凝胶的研究中，动态流变学数据可以作为评估凝胶化以及凝胶形成的能力之一，反映了复合水凝胶的相关理化性质[28]，因此，通过对RP-SA IPN 水凝胶流变学行为的研究分析，确定其有着广泛的应用前景。系统中大分子的结构形成可以通过动态测量确定粘弹性来解释，其中弹性由储能模量G'表示，而粘性由损耗模量G"解释[29]。在图4 所示的G'，G"与频率的关系中，随着频率的增加，大多数水凝胶的模量值增加。在整个频率范围内，所有水凝胶的G'值都是G"值的3～5 倍，表明所有水凝胶都具有稳定的结构和良好的粘弹性，RP-SA IPN 水凝胶的储存模量（G'）和损耗模量（G"）与频率的关系也表明了水凝胶具有固体状特征[30]。水凝胶中连接区的结构和数量是水凝胶力学性能的决定因素，RP-SA IPN 水凝胶的连接区由米蛋白凝胶链和海藻酸钠凝胶链形成，随着碎米蛋白浓度的增加，水凝胶结构中米蛋白凝胶链的增多，储能模量G′的平衡值从3488.8 增加到5511.2 Pa，水凝胶的力学性能不断提高。这也意味着可以通过改变米蛋白的浓度来调节水凝胶的流变特性，以获得更多基于米蛋白的水凝胶。

图4 不同碎米蛋白浓度对RP-SA IPN 水凝胶的储存模量G'（A）和损失模量G"（B）的影响Fig.4 Effect of different broken rice protein concentrations on the storage modulus G' (A) and loss modulus G" (B) of the RPSA IPN hydrogels

2.4 RP-SA IPN 水凝胶的溶胀特性

水凝胶的溶胀特性对于水凝胶的应用有着重要的意义[31]，溶胀率可以揭示凝胶体系中聚合物-聚合物和聚合物-溶剂的相互作用，反映IPN 水凝胶的力学性能。水凝胶的溶胀能力与凝胶网络中的交联程度和水凝胶的力学性能成反比。图5 描述了不同碎米蛋白浓度对RP-SA IPN 水凝胶溶胀率的影响。从图中可以看出，大部分RP-SA IPN 水凝胶在180 min后，溶胀率基本保持不变，水凝胶达到溶胀平衡；前60 min 内水凝胶的吸水速率很快，并且随着RP-SA IPN 水凝胶体系中碎米蛋白浓度的增加，溶胀率从约11.51 下降到约3.64，下降了约3 倍多。与低浓度碎米蛋白的RP-SA IPN 水凝胶相比，高蛋白浓度的IPN 水凝胶的溶胀率一般较低，这是由于凝胶体系中蛋白浓度的增加，疏水基团与亲水基团的比例较高，热处理蛋白发生热聚集后，在凝胶体系中构建的网络越多，水凝胶的结构越紧凑，水分子穿透的自由体积越小，膨胀速率越低[32]，这也是力学性能增加的原因。

图5 不同碎米蛋白浓度对RP-SA IPN 水凝胶的溶胀性的影响Fig.5 Effects of different broken rice protein concentrations on swelling properties of RP-SA IPN hydrogels

2.5 RP-SA IPN 水凝胶的水分分布

低场核磁LF-NMR 主要通过横向弛豫时间来反映水凝胶中不同状态水分的迁移规律。横向驰豫时间分布图中横坐标为横向驰豫时间，可以表征水凝胶中水的流动性，纵坐标是信号强度（质子密度），表示对应驰豫时间下的水分含量。横向弛豫时间中1～10 ms 为T2b，代表了凝胶中的强结合水；10～100 ms为T21，代表了凝胶中的弱结合水；100～1000 ms 为T22，代表了凝胶中的不易流动水；1000～10000 ms为T23，代表了凝胶中的自由水[32]。由图6 可见，在1～10000 ms 的弛豫时间内不同碎米蛋白浓度的水凝胶中水分分布的变化有3 个峰，分别代表强结合水、不易流动水和自由水，可以看出提高RP-SA IPN 水凝胶中碎米蛋白浓度后，水凝胶的驰豫时间变短，说明凝胶体系中的结合水碎米蛋白或海藻酸钠基团结合紧密，水分受到的束缚程度增强，凝胶的网络结构更紧密[33]。一般而言，凝胶的驰豫时间与水分子受到的束缚程度成反比，水的自由度越高，则测定时驰豫时间越长。而弛豫时间T2越短，水与底物结合越紧密，保水性越好；弛豫时间T2越长，水与底物的结合越松散，水分子越自由，保水性也越差[34−35]。

图6 不同浓度碎米蛋白对RP-SA IPN 水凝胶低场核磁共振弛豫时间（T2）分布的影响Fig.6 Effect of different concentrations of broken rice protein on the distribution of low-field NMR relaxation times (T2) of the RP-SA IPN hydrogels

由图7 可以看出碎米蛋白的浓度为80 mg/mL时，形成的凝胶其水分分布不均匀，局部颜色很亮（伪彩图中越红），在米蛋白浓度较低时，热处理形成的蛋白凝胶，凝胶网络较松散，在体系内无法相互缠绕，仅起到填充作用，从而导致形成的水凝胶网络结构比较松散，致使水的流动性更强，水分分布不均匀。而随着IPN 水凝胶中碎米蛋白浓度增加，伪彩图中红色区域逐渐减少，说明水分分布较为均匀，水的流动性降低，凝胶网络较为致密[25]。

图7 不同浓度碎米蛋白的RP-SA IPN 水凝胶水分分布的伪彩图Fig.7 Pseud-plot of water distribution of RP-SA IPN hydrogels at different concentrations of broken rice protein

3 结论

通过对RP-SA IPN 水凝胶的制备及性能研究，碎米蛋白浓度的改变对于水凝胶外在色度的影响较小，这对于它在食品中的应用而言，少了形态色度的限制。碎米蛋白浓度的增加可以改善水凝胶的外观形态，使制备的水凝胶外表更加平滑，并且显著提高了RP-SA IPN 水凝胶的储能模量和损耗模量，改善了水凝胶的质构性能，促进自由水向不易流动水的转变。在米蛋白浓度为140 mg/mL 时，弹性模量和凝胶强度的增长趋势较为平缓，米蛋白浓度为160 mg/mL时，流变性能和质构性能最佳。此外，在较低蛋白浓度下的RP-SA IPN 水凝胶具有较高的溶胀率，但其保水性也较差，随着蛋白浓度的提高，水凝胶的溶胀率降低，保水性提高，水分分布也较为均匀。综上所述，改变碎米蛋白浓度对IPN 水凝胶特性有着积极作用，而由于RP-SA IPN 水凝胶具有优良的力学性能和溶胀性能，所形成的水凝胶对食品工业具有非常重要的意义，它可以为碎米蛋白凝胶在具有更高要求的新型食品应用中提供一定的理论基础。