超声细胞破碎仪辅助提取桑葚多糖及其抗氧化性分析

张秋红

(商丘学院风景园林学院，河南 商丘 476000)

桑葚(FructusMori)为桑科植物的成熟果穗，是一种药食同源植物，具有抗炎症[1]、预防脑缺血[2]等作用。多糖作为桑葚的主要活性物质之一，具有降血糖、抗氧化、保护肾脏调节免疫等药理作用[3-4]。目前桑葚多糖的提取方法有酶法提取、超声波辅助提取、酶—超声波联合提取、微波辅助提取、大孔吸附树脂纯化提取、热水提取法、高速剪切提取等[5-7]。但这些方法工艺复杂、提取时间长、提取率低。王庆等[8]报道了提取方法对多糖得率和活性都有一定的影响。祝新媛[9]研究了不同提取方法对桑葚多糖提取率的影响，得出超声辅助提取法的提取率比单独热水提取法的高。与传统超声波清洗机辅助提取法比较，细胞破碎仪在桑葚样品中可形成更强烈的空化效应，桑葚样品的细胞壁被仪器形成的高度局部化温度、冲击波和剪切力破坏，增大了样品与萃取浸提液的接触面积[10]。因此，研究拟采用超声波细胞破碎仪辅助热水浸提法提取桑葚多糖，并对桑葚多糖的抗氧化能力进行分析，为今后桑葚多糖的分离、纯化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑桑葚干：新疆和田市丝路果果特产；

石油醚(沸程30～60 ℃)、三氯甲烷、正丁醇、95%乙醇：分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

超声波细胞破碎仪：TL-ST400型，江苏天翎仪器有限公司；

高速多功能粉碎机：RHP-2000A型，天津荣浩机电设备有限公司；

数显恒温水浴锅：HH-4型，上海树立仪器仪表有限公司；

高速离心机：TCL-16型，常州金坛良友仪器有限公司；

粗脂肪测定仪：SZF-06A型，上海洪纪仪器设备有限公司；

电热鼓风干燥箱：DGH-9140A型，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚样品处理 将桑葚干样品烘干至恒重，粉碎，过70目筛后密封保存备用。

1.3.2 脱脂 参照GB 5009.6—2016并修改。称取处理好的桑葚样品4.000 g，水浴温度70 ℃回流抽提4 h，控制每分钟80滴左右。脱脂后滤掉废液得桑葚样品。

1.3.3 细胞破碎仪辅助热水浸提桑葚多糖 称取脱脂后的桑葚样品1.000 g，按料液比1∶30 (g/mL)加入蒸馏水，65 ℃恒温水浴锅中用细胞破碎仪辅助浸提，将超声波细胞破碎仪变幅杆末端插入液面8 mm并使其位于容器中心位置。变幅杆转换开关打到Φ6，设置超声时间1.2 s，间歇时间1.5 s，用纱布过滤混合物， 3 500 r/min离心10 min，收集上清液，65 ℃水浴浓缩至液体体积为10 mL。

1.3.4 桑葚多糖的脱蛋白 根据文献[9]稍作修改：将浓缩后的桑葚样品置于分液漏斗中，按体积比1∶2加入Sevag试剂(V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1)，充分摇匀，静置，待分液漏斗中液体分层完毕后，除去底层的有机溶剂及中间层的蛋白质，收集上层液，3 500 r/min离心10 min，除去残留蛋白质，收集上清液备用。

1.3.5 桑葚多糖的制备 向脱蛋白后的上清液中加入4倍体积95%乙醇，混匀静置片刻后沉淀析出，3 500 r/min离心10 min，弃上清，将沉淀放置于蒸发皿中，65 ℃干燥1.5 h，即为桑葚多糖提取物。

1.3.6 桑葚多糖得率测定 按式(1)计算桑葚多糖得率[9]。

X=M/m×100%，

(1)

式中：

X——桑葚多糖得率，%；

M——桑葚多糖的质量，g；

m——脱脂桑葚粉的质量，g。

1.3.7 单因素试验

(1) 浸提时间：固定料液比1∶30 (g/mL)，浸提温度60 ℃，细胞破碎仪超声时间7.5 min，超声功率100 W，考察浸提时间[11](20，30，40，50，60 min)对桑葚多糖得率的影响。

(2) 料液比：固定浸提时间30 min，浸提温度60 ℃，超声时间7.5 min，超声功率100 W，考察料液比[1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 (g/mL)] 对桑葚多糖得率的影响。

(3) 超声时间：固定浸提时间30 min，料液比1∶30 (g/mL)，浸提温度60 ℃，超声功率100 W，考察超声时间(7.5，10.0，12.5，15.0，17.5 min)对桑葚多糖得率的影响。

(4) 超声功率：固定浸提时间30 min，料液比1∶30 (g/mL)，超声时间15 min，浸提温度60 ℃，考察超声功率(100，120，140，160，180 W)对桑葚多糖得率的影响。

(5) 浸提温度：固定浸提时间30 min，料液比1∶30 (g/mL)，细胞破碎超声时间15 min，超声功率160 W，考察浸提温度(30，40，50，60，70 ℃)对桑葚多糖得率的影响。

1.3.8 桑葚多糖的抗氧化性

(1) DPPH自由基清除能力：根据文献[9]。

(2) 羟自由基清除能力：根据文献[9]并修改，取1 mL硫酸亚铁溶液(9 mmol/mL)，1 mL水杨酸的无水乙醇溶液(9 mmol/mL)，1 mL不同质量浓度桑葚多糖样液(0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90 mg/mL)，1 mL H2O2溶液(8.8 mmol/mL)后摇匀，37 ℃ 反应30 min，测定517 nm处吸光值A1。用1 mL蒸馏水代替桑葚多糖样液，记517 nm处吸光值为A0，用1 mL 蒸馏水代替过氧化氢溶液，记517 nm处吸光值为A2。以维生素C为对照品，按式(2)计算羟自由基清除活性。

X=[1-(A1-A2)/A0]×100%，

(2)

式中：

X——羟自由基清除率，%。

1.4 数据处理

试验数据以平均值±标准差表示，每个试验重复3次，利用SPSS 22.0、Office 2016软件绘图和统计分析数据。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图1(a)可知，在一定浸提时间内，多糖溶出量会增加，但长时间的高温浸提也会导致桑葚多糖的降解[12]，桑葚多糖在浸提时间为30 min时得率达到最大值(6.16±0.02)%。因此，适宜的浸提时间为30 min，与谭西[13]的研究相比，细胞破碎仪辅助提取的效果更好，但浸提时间对得率的影响变化趋势较小。

图1 各因素对桑葚多糖得率的影响

由图1(b)可知，料液比过小，不利于桑葚多糖的溶出，料液比增大桑葚多糖溶出量增加，料液比为1∶30 (g/mL)时，桑葚多糖得率达最高值(6.19±0.06)%。当桑葚多糖充分溶出后，溶剂中桑葚多糖的量已基本恒定，再增大溶剂的量，溶剂中桑葚多糖的量也不会增加[14]，因此适宜的料液比为1∶20～1∶40 (g/mL)。

由图1(c)可知，一定范围内超声时间延长有助于提高桑葚多糖得率，但长时间超声会导致部分多糖结构发生降解，使得到的水溶性多糖分支增加[15]，得率下降, 在15 min时达最大值(6.20±0.10)%。因此适宜的超声时间为12.5～17.5 min。景荣琴等[11]研究得到的超声时间为23.5 min，较试验时间长，说明细胞破碎仪辅助提取桑葚多糖更省时高效。

由图1(d)可知，随着超声功率的增大，超声波空化作用增强，产生的空化泡破碎越剧烈，桑葚多糖得率越高。但超声功率过高，桑葚多糖结构可能被破坏而相对减少[16],在160 W时达最大值(6.23±0.04)%。魏然等[17]研究得到的最佳超声功率为360 W，远高于试验的超声功率，进一步证实细胞破碎仪的空化效应比超声波清洗机更强。因此，适宜的超声功率为140～180 W。

由图1(e)可知，桑葚多糖得率随浸提温度的升高而增大，当浸提温度为40 ℃时，多糖得率达最大值(6.25±0.02)%，之后逐渐下降，与陈禹等[18]、廖登未等[19]的变化趋势一致。浸提液温度的升高会加速水分子运动，促进桑葚多糖溶出，提高桑葚多糖得率，但过高的温度可能会使桑葚多糖发生降解，破坏多糖的糖苷键，使桑葚多糖得率降低。故适宜的浸提温度为30～50 ℃。

2.2 正交试验优化

以单因素试验结果为依据，选择细胞破碎仪超声功率、料液比、超声时间以及浸提温度为因素，进行L9(34)正交试验设计。正交试验因素水平见表1，正交试验设计及结果见表2。

表1 因素水平表

由表2可知，各因素对桑葚多糖得率的影响主次关系为超声功率>浸提温度>超声时间>料液比。由表3可知，超声功率、超声时间及浸提温度对桑葚多糖得率的影响均显著(P<0.05)，料液比的影响不显著，与极差分析结果一致。桑葚多糖最优的提取条件组合为A2B1C2D1，即超声功率160 W、超声时间12.5 min、料液比1∶30 (g/mL)、浸提温度30 ℃。但实际最优组合为A2B3C1D2，即超声功率160 W、超声时间17.5 min、料液比1∶20 (g/mL)、浸提温度40 ℃。由于两组试验结果不一致，进行验证实验(n=3)，得桑葚多糖得率分别为(6.63±0.07)%，(6.28±0.12)%。因此桑葚多糖最佳浸提条件为超声功率160 W、超声时间12.5 min、料液比1∶30 (g/mL)、浸提温度30 ℃。

表2 正交试验设计及结果

表3 正交设计方差分析†

2.3 桑葚多糖的抗氧化能力

2.3.1 清除DPPH·活性 由图2可知，当桑葚多糖样品质量浓度从0.10 mg/mL升高至0.90 mg/mL时，其对DPPH·的清除率随溶液质量浓度的增加逐渐增大，与祝新媛[9]的研究结论一致。当样品质量浓度>0.70 mg/mL，桑葚多糖对DPPH·的清除率趋于平缓，显著弱于相同浓度下维生素C的清除能力(P<0.05)。

图2 对DPPH·的清除能力

2.3.2 清除·OH活性 由图3可知，桑葚多糖对·OH有较强的清除能力，且清除活性与样品质量浓度呈正比。当多糖质量浓度为0.90 mg/mL时，桑葚多糖对·OH的清除率达(76.21±2.21)%，但显著低于对照品维生素C的[(87.29±3.15) %](P<0.05)，说明桑葚多糖对·OH有一定的清除力，与李德龙等[20]研究的结论一致。

图3 对·OH的清除能力

3 结论

采用超声波细胞破碎仪辅助热水浸提法提取了桑葚多糖。结果表明，各因素对桑葚多糖提取率影响顺序为超声功率>浸提温度>超声时间>料液比，且最佳提取工艺条件为浸提时间30 min、料液比1∶30 (g/mL)、超声功率160 W、超声时间12.5 min、浸提温度30 ℃，该条件下桑葚多糖得率为(6.63±0.07)%。此外，桑葚多糖具有一定的抗氧化性，但清除DPPH·和·OH的能力较维生素C的弱。

后期研究将进一步从以下方面入手：① 对桑葚多糖抗氧化活性成分构效关系进行研究；② 对桑葚多糖进行分离纯化以提高多糖纯度；③ 对桑葚多糖的药理效果如溃疡性结肠炎保护作用、抗急性酒精性肝损伤活性进行探究。