新型冠状病毒辅助蛋白ORF3a、ORF3b的致病机制研究

高文欣, 李希琳, 傅煜轩

(苏州大学生物医学研究院, 江苏 苏州, 215000)

作为一种新发传染病病原体，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)全球大流行在世界范围内造成了巨大的健康危机和无以估量的损失，故亟需针对病毒的致病机制进行详细阐述和研究[1]。SARS-CoV-2为正股单链RNA病毒，基因组长约30 kb, 包含多达8个非结构基因(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8a、ORF8b和ORF9)[2-3]。ORF3作为冠状病毒特有的重要非结构基因，可编码翻译2种辅助蛋白，即ORF3a和ORF3b。相关研究[4]表明，冠状病毒辅助蛋白ORF3a、ORF3b广泛参与宿主免疫调控，在病毒的致病性中发挥着重要作用，且能够反映病毒毒力，还是病毒RNA复制、组装以及释放所必需的。不同冠状病毒ORF3a、ORF3b基因序列保守性较差，易突变或缺失[5]。目前, SARS-CoV-2辅助蛋白ORF3a、ORF3b的功能尚不明确，本研究探讨了特异性辅助蛋白ORF3a、ORF3b对SARS-CoV-2致病性的影响，以期为深入理解其致病机制并提出针对性防控策略奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人肺细胞系A549细胞和人肾上皮细胞系293T细胞购自美国ATCC细胞库; ploy(I∶C)购自美国Sigma公司; RIPA裂解液、Lipofectamine 3000、SYBR Green Master Mix试剂均购自美国Life Technologies公司; 二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司; 多聚甲醛、TritonX-100化学试剂购自南京化学试剂股份有限公司; MyD88、TRAF6和GAPDH一抗均购自美国CST公司; pFLAG-NC、pFLAG-ORF3a、pFLAG-ORF3b表达载体和S、M、E及N表达载体购自美国Addgene公司; PrimeScript RT Master Mix逆转录试剂盒购自大连TaKaRa公司; ABI-7500实时定量聚合酶链式反应仪(美国Applied Biosystems公司); Olympus FluoView FV10i荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 总RNA提取及炎症因子检测

将A549细胞铺板，密度为60%～80%, 对A549细胞予以ploy(I∶C)刺激并通过Lipofectamine 3000转染ORF3a或ORF3b表达载体，设置2组分别转染ORF3a表达载体(pFLAG-ORF3a组)、ORF3b表达载体(pFLAG-ORF3b组)，并设置未处理组(Mock组)和单纯ploy(I∶C)刺激组(control组)。24 h后通过Trizol试剂对各组细胞进行总RNA提取，使用PrimeScript RT Master Mix逆转录试剂盒进行逆转录，以GAPDH为内参，使用SYBR Green Master Mix试剂通过ABI-7500实时定量聚合酶链式反应仪进行实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)。设置40个循环反应，以所得Ct平均值计算基因表达量。引物序列: β干扰素(IFN-β)正向引物5′-TAGCACTGGCTGGAATGAG-3′, 反向引物5′-GTTTCGGAGGTAACCTGTAAG-3′; 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)正向引物5′-CCCAGGGACCTCTCTCTAATCA-3′, 反向引物5′-GCTACAGGCTTGTCACTCGG-3′; 白细胞介素-1β(IL-1β)正向引物5′-AATCTGTACCTGTCCTGCGTGTT-3′, 反向引物5′-TGGGTAATTTTTGGGATCTACACTCT-3′; 白细胞介素-6(IL-6)正向引物5′-AGTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC-3′, 反向引物5′-TGACAAACAAATTCGGTACATCCT-3′;GAPDH正向引物5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′, 反向引物5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

1.3 蛋白质印迹法(Western blot)检测蛋白表达

将密度为60%～80%的A549细胞铺板，给予IFN-β刺激后，应用Lipofectamine 3000转染ORF3a或ORF3b表达载体，分别设置为IFN-β+pFLAG-ORF3a组[IFN-β(+)、pFLAG-ORF3a(+)、pFLAG-ORF3b(-)]、IFN-β+pFLAG-ORF3b组[IFN-β(+)、pFLAG-ORF3a(-)、pFLAG-ORF3b(+)], 并设置未处理组[IFN-β(-)、pFLAG-ORF3a(-)、pFLAG-ORF3a(-)]和IFN-β刺激组[IFN-β(+)、pFLAG-ORF3a(-)、pFLAG-ORF3a(-)], 24 h后，加入RIPA裂解液冰上裂解15 min, 以12 000 g离心10 min, 取上清液转移至新的离心管，通过BCA法检测蛋白浓度后，将1×上样缓冲液和蛋白混合, 98 ℃煮5 min, 进行上样电泳，每个样本上样量总蛋白为50 μg。转膜、封闭2 h后，给予MyD88、TRAF6和GAPDH一抗4 ℃孵育过夜，以TBST缓冲液洗涤3次后，加二抗室温孵育60 min, 用TBST缓冲液洗涤3次后进行曝光。

1.4 SARS-CoV-2假病毒颗粒收集及感染

用S、M、E、N表达载体转染293T细胞(转染比例为8∶6∶8∶3), 设置2组分别转染ORF3a表达载体(pFLAG-ORF3a组)、ORF3b表达载体(pFLAG-ORF3b组)，并设置未转染组(Mock组)和空载转染组(pFLAG-NC组)。72 h后，收集细胞上清液，以10 000 g离心30 min去除细胞碎片，再以120 000 g超速离心3 h, 收集病毒颗粒沉淀，通过无血清培养基悬浮后，将收集到的4组SARS-CoV-2假病毒颗粒加入过表达血管紧张素转化酶2(ACE2)的A549细胞(A549-ACE2)中, 24 h后，细胞以4%多聚甲醛固定，使用磷酸盐缓冲液(PBS)轻洗，通过倒置荧光显微镜观察并采集图像，统计各组被SARS-CoV-2假病毒感染的细胞(GFP阳性细胞)占比。

1.5 统计学分析

使用GraphPad软件8.0进行图形表示和统计分析，所有结果均显示为3次独立实验的平均值±标准差，不同处理组之间的差异采用t检验或单因素方差分析(one-way ANOVA)进行分析，双侧检验P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ORF3a、ORF3b对SARS-CoV-2假病毒颗粒组装与释放的影响

将各组SARS-CoV-2假病毒颗粒加入A549-ACE2中, 24 h后通过荧光显微镜观察并统计，结果显示, pFLAG-ORF3a组、pFLAG-ORF3b组细胞组装和释放出的SARS-CoV-2假病毒颗粒量均高于Mock组和pFLAG-NC组，差异有统计学意义(P<0.001), 见图1。由此表明, ORF3a、ORF3b可促进SARS-CoV-2假病毒颗粒的组装与释放。

A: 各组A549-ACE2细胞经SARS-CoV-2假病毒感染的荧光显微镜下观察结果(放大100倍); B: 各组GFP阳性细胞情况比较(与Mock组、pFLAG-NC组比较, ***P<0.001)。图1 SARS-CoV-2假病毒感染A549-ACE2细胞的荧光显微镜下观察与统计

2.2 ORF3a、ORF3b对宿主细胞干扰素应答的影响

给予A549细胞ploy(I∶C)刺激以诱导干扰素应答，并转染ORF3a或ORF3b表达载体, 24 h后检测各组IFN-β表达水平。qRT-PCR检测结果显示, control组IFN-β相对表达量高于Mock组，而pFLAG-ORF3a组、pFLAG-ORF3b组IFN-β相对表达量低于control组，差异均有统计学意义(P<0.001), 说明ORF3a、ORF3b表达均可显著抑制ploy(I∶C)所诱导的IFN-β表达水平，见图2A。Western blot检测结果显示, IFN-β刺激组MyD88、TRAF6蛋白表达量高于未处理组，而IFN-β+pFLAG-ORF3a组、IFN-β+pFLAG-ORF3b组MyD88、TRAF6蛋白表达量低于IFN-β刺激组，差异均有统计学意义(P<0.001), 见图2B, 提示ORF3a、ORF3b表达均能抑制干扰素信号通路中关键蛋白MyD88、TRAF6的表达水平，进而抑制干扰素应答。

A: 各组细胞IFN-β相对表达量比较(组间比较, ***P<0.001); B: 各组干扰素信号通路蛋白表达量的Western blot检测结果。图2 ORF3a、ORF3b对宿主细胞干扰素应答的影响

2.3 ORF3a、ORF3b对宿主细胞炎症应答的影响

采用qRT-PCR法检测A549细胞转染ORF3a或ORF3b表达载体后的炎症因子表达情况，结果显示, pFLAG-ORF3a组、pFLAG-ORF3b组炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6相对表达量均高于pFLAG-NC组，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.001), 见图3，说明ORF3a和ORF3b可诱导宿主细胞炎症因子的表达。

A: 各组细胞TNF-α相对表达量比较; B: 各组细胞IL-1β相对表达量比较; C: 各组细胞IL-6相对表达量比较。与pFLAG-NC组比较, **P<0.01, ***P<0.001。图3 ORF3a、ORF3b对宿主细胞炎症应答的影响

3 讨 论

SARS-CoV-2目前仍处于全球大流行状态，严重威胁着人类的健康与生活，但SARS-CoV-2的致病性尚未阐明，故亟需深入研究以控制疫情传播态势[6-7]。ORFs是一类零散分布在结构基因之间或内部的编码39～274个氨基酸的特异性蛋白，保守性较差，易突变[3-4]。这些ORFs蛋白对病毒的复制、致病性或免疫调控发挥着重要作用，包括促进炎症产生、抑制Ⅰ型干扰素产生以及诱导细胞凋亡等[8-9]。相关研究[10]指出, ORF8a或ORF8b通过泛素化酶体途径介导干扰素调节因子3(IRF3)降解，抑制Ⅰ型干扰素的产生，协助严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)逃避宿主的免疫防御。另有报道[11]发现，有些ORFs蛋白是冠状病毒的重要毒力因子及致病因子，具有较好的免疫原性，例如SARS-CoV的ORF3b蛋白能够刺激机体产生相应的特异性抗体，具备良好的免疫原性。

SARS-CoV-2理论上至少能够编码翻译7个特异性非结构蛋白(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF 7b、ORF8和ORF10)。虽然SARS-CoV-2和SARS-CoV的病毒基因组序列相近，两者生活周期及其所引发疾病的临床表现也类似，但对比分析氨基酸序列可发现, SARS-CoV-2与SARS-CoV最主要的差异性序列表现在S蛋白(76%)和非结构蛋白ORF3(72%)、ORF8(40%)中[8-9]。ORF3作为冠状病毒特有的重要非结构蛋白，在病毒生活周期和致病性方面至关重要。ORF3a包含6个功能域(Ⅰ～Ⅵ), 这6个功能域分别与病毒毒力、感染性、离子通道形成和病毒释放紧密相关，但SARS-CoV-2的ORF3a的6个功能域在氨基酸序列上均与SARS-CoV的ORF3a具有差异性[12], 且SARS-CoV-2的ORF3b蛋白只有22个氨基酸，远少于SARS-CoV的ORF3b蛋白的154个氨基酸[13-14], 提示SARS-CoV-2编码翻译的ORF3a、ORF3b蛋白的功能可能与SARS-CoV并不同。此外，感染SARS-CoV-2后的Vero细胞中，除了结构基因蛋白(N、S、M)外, ORF3a是胞内最丰富的表达转录本之一，而ORF10可能并不表达[2], 进一步提示ORF3蛋白在SARS-CoV-2生活周期及致病过程中扮演着重要角色。

本研究聚焦于SARS-CoV-2特异性非结构蛋白ORF3a、ORF3b在调控病毒组装、释放以及干扰素、炎症应答过程中的作用。SARS-CoV-2假病毒组装和释放检测结果显示, ORF3a和ORF3b可促进SARS-CoV-2假病毒颗粒的组装和释放，提示ORF3a和ORF3b在辅助病毒颗粒组装和释放等过程中扮演着重要角色，其活性可能与宿主中的病毒载量有关。干扰素表达是宿主抵抗病毒等微生物感染最重要的抗感染应答之一，本研究发现, ORF3a、ORF3b表达可显著抑制ploy(I∶C)诱导的IFN-β表达水平，进一步证明干扰素应答的减弱是通过抑制干扰素信号通路中关键蛋白MyD88、TRAF6表达水平来实现的，提示ORF3a和ORF3b的表达能够为病毒提供有利的复制和组装环境，使得病毒更高效地复制和组装，并拮抗宿主抗病毒反应。本研究还发现, ORF3a或ORF3b的表达可诱导炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达，说明ORF3a、ORF3b可诱导宿主细胞炎症因子表达，提示宿主机体的炎症损伤可能与病毒的ORF3a、ORF3b表达有关。

综上所述，非结构蛋白ORF3a、ORF3b能够促进SARS-CoV-2组装、释放，诱导宿主炎症应答，并抑制宿主干扰素表达。本研究为更好地了解病毒编码翻译产生的特异性非结构蛋白在SARS-CoV-2致病性中的作用提供了新的见解，也为新型冠状病毒肺炎致病机制的深入研究和针对性药物的研发等提供了新的依据，同时能够为设计改造减毒病毒株或无毒病毒株提供理论基础，并为深入理解病毒诱导宿主固有免疫应答与炎症因子风暴的机制和遏制SARS-CoV-2的传播与致病性提供创新性科学理论。