双氢青蒿素对MRL/lpr狼疮鼠的治疗作用及其对滤泡辅助性T细胞的调控作用

薛美娟，黄俊霞，杨 骥

复旦大学附属中山医院皮肤科，上海 200032

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是多种因素共同作用而导致免疫功能异常的自身免疫性疾病，可累及全身多种组织和器官。SLE的主要特征是产生大量自身抗体，形成免疫复合物在组织中沉积，导致补体激活，自身反应性细胞增多［1-2］。滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cells，TFH）作为一类特殊的CD4＋T细胞亚群，其主要作用是辅助B细胞分化增殖、抗体分泌，B细胞产生大量自身免疫性抗体，造成SLE免疫炎症损伤［3-4］。TFH细胞及分泌的IL-21增多与SLE病情活动度、自身抗体分泌正相关［5-6］。

青蒿素及其衍生物除抗疟作用外，双氢青蒿素高效且低毒，有较明显的免疫抑制作用，有良好开发前景，但有关双氢青蒿素治疗SLE的免疫研究机制仍较少［7-10］。有研究［11］表明，双氢青蒿素在SLE中发挥免疫调节作用，通过调节Th17/Treg平衡，抑制Th17细胞分化及促炎作用，促进Treg细胞分化及其免疫抑制作用。迄今未发现关于双氢青蒿素对狼疮鼠体内外TFH细胞的调控研究。本研究旨在探讨双氢青蒿素对狼疮鼠的治疗作用，及其在体内外对TFH细胞分化的调控作用，为双氢青蒿素应用于红斑狼疮治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料雌性MRL/lpr狼疮鼠购买自中科院上海生命科学院斯莱克实验动物有限公司；双氢青蒿素（相对分子质量284.35）购买自CSNpharm公司；IL-21和IL-6于Peprotech公司购买；初始CD4＋T细胞分选试剂盒和T细胞活化/扩增试剂盒购买自德国美天旎公司（Miltenyi Biotec）；尿蛋白检测试剂盒来自南京建成生物工程研究所；异硫氰酸荧光素（FITC）-CD4流式抗体、别藻蓝蛋白（APC）-CXCR5流式抗体、藻红蛋白（PE）-PD-1流式抗体均来自于BD公司。IL-21酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购买自R&D Systems公司。

1.2 实验动物分组及处理12只12周龄的雌性MRL/lpr鼠，饲养于我院SPF级动物房，体质量（30.1±2.1）g。随机数字表法将小鼠随机分为2组，双氢青蒿素治疗组和对照组，每组各6只。通过查阅相关文献［11-13］及咨询CSNpharm公司实验人员，100~150 mg/kg双氢青蒿素灌胃治疗可有效治疗狼疮症状。本研究体内实验予150 mg/kg双氢青蒿素灌胃给药，1次/d，持续给药4至16周，对照组以同样方法PBS溶液灌胃给药。治疗结束时使用考马斯亮蓝法检测24 h尿蛋白，之后处死狼疮鼠，取脾称重，剪碎研磨脾脏从其中分离单个核细胞，之后用FITC-CD4、PE-PD-1、APC-CXCR5流式抗体，4℃避光染色20 min，上机检测圈出CD4＋T淋巴细胞，再从CD4＋T的淋巴细胞图中圈出PD-1＋和CXCR5＋的淋巴细胞，计算CXCR5＋PD-1＋淋巴细胞在CD4＋细胞中的百分比。取肾脏，放入4%多聚甲醛固定，其后经脱水透明处理后，样品浸蜡包埋，病理切片机切片，根据H-E染色进行肾脏病理评分，评分方法参考该文献［14］。收集血清，ELISA试剂盒检测治疗组和对照组抗ds-DNA抗体及ANA抗体含量。

1.3 体外TFH细胞培养诱导分化及流式检测从对照组MRL/lpr狼疮鼠中分离单个核细胞，初始CD4＋T细胞试剂盒分选初始CD4＋T细胞，在细胞培养液中加入10 ng/mL IL-21、20 ng/mL IL-6和T细胞活化/扩增试剂盒中的MACSiBeads Particles诱导分化5 d，不同浓度梯度（0 μM、0.1 μM、1.0 μM、10 μM）双氢青蒿素干预，共分为4组。体外培养5 d后，用FITC-CD4、PE-PD-1、APCCXCR5流式抗体4℃避光染色20 min，流式细胞仪检测CD4＋CXCR5＋PD-1＋T细胞在CD4＋T细胞中的比例。

1.4 IL-21水平测定收集上述TFH细胞培养上清，根据IL-21 ELISA试剂盒说明书检测TFH细胞分化过程中分泌的IL-21含量。

1.5 统计学处理采用GraphPad Prism 7.0软件，通过Studentt检验和方差分析进行统计学分析，计量资料以x±s表示。检验水准（α）为0.05。

2 结 果

2.1 双氢青蒿素对MRL/lpr狼疮鼠的治疗作用结果（图1、表1）显示：双氢青蒿素系统治疗MRL/lpr小鼠4周后与对照组相比较，24 h尿蛋白含量更低，分别为（1 536±150.1）μg/24 h和（2 548±93.30）μg/24 h，t＝5.726，P＜0.01。双氢青蒿素治疗组肾脏病理评分是2.410±0.535，对照组为5.713±0.662，t＝6.716，P＜0.01。治疗组抗ds-DNA抗体低于对照组［（345.3±29.00）vs（477.8±20.07）IU/mL，t＝7.514，P＜0.01］，治疗组ANA抗体也低于对照组［（514.5±19.64）vs（726.3±16.27）IU/mL，t＝8.302，P＜0.01］。

图1 双氢青蒿素治疗MRL/lpr狼疮鼠肾炎H-E染色图

表1 双氢青蒿素治疗组对MRL/lpr狼疮鼠的治疗作用

2.2 双氢青蒿素抑制MRL/lpr狼疮鼠体内外的TFH细胞分化双氢青蒿素治疗MRL/lpr狼疮鼠4周后，可有效抑制MRL/lpr狼疮鼠脾脏增生，治疗组脾脏重量（0.28±0.03）g，对照组（0.69±0.04）g（t＝13.83，P＜0.01）。 双 氢 青蒿素治疗组和对照组脾脏中TFH细胞比例分别为（12.40%±2.726%） 和（36.33%±2.750%），t＝10.71，P＜0.01，见图2。体外培养TFH细胞，0 μM与 0.1 μM、1.0 μM、10 μM双氢青蒿素干预，CD4＋CXCR5＋PD-1＋TFH细胞比例和分泌的IL-21水平随着双氢青蒿素浓度增加而降低，相邻2组间差异均有统计学意义（图3）。

图2 流式检测MRL/lpr狼疮鼠脾脏中CD4＋ CXCR5＋ PD-1＋ TFH细胞百分比

图3 双氢青蒿素体外抑制MRL/lpr狼疮鼠TFH细胞分化及其IL-21的分泌

3 讨 论

SLE是一种常见的累及多系统多器官的自身免疫性疾病，目前主要的治疗药物为糖皮质激素，某些特定类型的SLE亦可使用环磷酰胺和生物制剂等免疫抑制剂，但长期使用糖皮质激素和免疫抑制药物会引起诸多严重不良反应。因此，进一步研究SLE免疫学发病机制，寻找新的高效低毒治疗药物，对提高SLE诊疗水平具有重要意义。

SLE是一种以B细胞过度活化和致病性自身抗体形成增加为特征、累及全身系统器官的自身免疫性疾病。TFH细胞主要辅助B细胞向浆细胞分化、促进抗体分泌。诸多前期研究［5,15］发现SLE患者外周血中TFH细胞比例增多，与自身抗体滴度正相关，并与SLE病情活动密切相关。在MRL/lpr狼疮鼠中也证实TFH细胞和其分泌的IL-21与生发中心扩增和自身抗体分泌密切相关［6］。SLE发病与TFH细胞过度活化和IL-21过量分泌密切相关，因此抑制TFH细胞分化和功能可能进一步抑制B细胞过度活化和抗体分泌，从而TFH细胞可作为治疗SLE的有效靶点［16］。

自屠呦呦教授团队因研发青蒿素获诺贝尔奖后，青蒿素及其衍生物的研究备受关注。青蒿素化学结构中含过氧桥结构，可产生大量水溶性和脂溶性衍生物，如双氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯等。双氢青蒿素除有抗疟疾作用外，还具有免疫调节作用［7,17-18］。例如，有研究［9］显示，双氢青蒿素衍生物DC32通过恢复Treg/Th17平衡和下调IL-6来减轻小鼠胶原诱导的关节炎。双氢青蒿素通过抑制MRL/lpr鼠中Toll样受体4信号通路的激活和脾细胞中Ⅰ型干扰素的产生进而缓解狼疮炎症损伤［13］。本研究发现双氢青蒿素可有效缓解狼疮鼠肾脏损伤，降低24 h尿蛋白、抗ds-DNA抗体和ANA抗体滴度，可有效抑制狼疮鼠脾脏增生、抑制TFH细胞增生。体外研究表明，双氢青蒿素可剂量依赖性抑制TFH细胞分化及IL-21的分泌，提示双氢青蒿素可能通过抑制TFH细胞扩增分化及其细胞因子分泌，从而达到治疗狼疮的作用。

综上所述，本研究仅从双氢青蒿素对TFH细胞的影响揭示了部分治疗机制，而缓解狼疮发病的其他机制还有待更多研究。双氢青蒿素具有较为明确的抗炎和免疫调节作用，随着相关研究的增多，有望应用于SLE等自身免疫性疾病的治疗。

利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。