马铃薯间作对土壤微生物代谢功能多样性的促进效应及其氮素调控作用*

王 顶,李 欢,伊文博,陈林康,赵 平,龙光强**

(1.云南农业大学农业农村部云南耕地保育科学观测实验站 昆明 650201; 2.云南农业大学资源与环境学院 昆明 650201)

土壤微生物多样性对维持土壤生态服务功能多样性,如有机碳转化、养分循环、土传病害控制等方面发挥着重要作用,是诸多生物地球化学过程的关键驱动力。土壤微生物功能多样性作为土壤健康的关键指标,影响着诸多生物地球化学循环过程。近几年,大量的研究发现,地下微生物多样性的提高促进了土壤养分转化、根系活性和碳的周转。然而,地下土壤微生物的功能多样性对地上作物多样性种植的响应机制尚不清楚。

间作是在同一块土地上同时种植两种或两种以上作物,是一种典型的地上作物多样性种植模式。由于在提高产量、防治病害和资源利用等方面的优势,间作在世界范围内得到广泛应用。一方面,间作后地下土壤温度、含水量和土壤有机碳(SOC)含量等土壤理化性状发生改变。有研究表明,与单作相比,黍子()和绿豆()间作后土壤温度和含水量分别增加1.61 ℃和12.1%。小麦()和玉米()连续多年间作后,与单作相比,SOC含量平均提高3%。间作后的这些改变将直接或间接影响地下微生物代谢活性和功能多样性。因此,对于间作导致的土壤理化性状的改变,如何影响地下土壤微生物代谢活性和功能多样性值得关注。

氮素作为农田生态系统中的限制性元素,可直接(改变土壤氮素有效性)和间接(增加光合产物的氮素输入)影响土壤微生物的代谢活性、功能多样性及对不同碳源的利用能力。在长期连作的蚕豆()土壤中发现,施氮增加了微生物对活性碳源(碳水化合物)的利用,但降低了对惰性碳源(胺类)的代谢能力。间作后会对氮素的有效性产生影响,但是间作和施氮后这种交互影响机制对地下微生物功能多样性的影响机制仍不清楚。因此本研究选取我国亚热带和温带地区广泛种植的玉米||马铃薯()间作系统,并与单作马铃薯对照,同时设置4个施氮水平,研究间作和施氮对马铃薯种植土壤中微生物代谢活性和功能多样性的影响。阐明这一机理,可加深对地上多样性种植影响地下微生物功能多样性的理解,对了解多样性种植系统中土壤多功能性的氮素调控作用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样地概况与试验设计

本研究在位于云南省昆明市云南农业大学寻甸大河桥农场(23°32′N、103°13′E)进行,始于2014年,试验区属亚热带季风气候,年平均气温 14.7 ℃,年降水量 1040 mm。土壤类型为酸性红壤,pH 6.79,土壤有机质含量为18.4 g·kg,碱解氮87.3 g·kg,速效磷2.5 mg·kg,速效钾117.8 mg·kg。

试验采用随机区组设计,设置马铃薯单作(MP)和玉米马铃薯间作(IP)两种种植模式。每个种植模式包含4个施氮量水平:不施氮(N0,0 kg·hm)、低氮(N1,常规施氮基础上减氮50%,62.5 kg·hm)、常规施氮(N2,125 kg·hm)和高氮(N3,常规施氮基础上增氮50%,187.5 kg·hm),共8个处理,每个处理3次重复,共24个小区,小区面积32.5 m(5 m×6.5 m)。单作马铃薯株距和行距分别为35 cm和50 cm; 间作采用2∶2的替代种植方式,每间隔两行,两行马铃薯被两行玉米替代。间作玉米株距25 cm,行距50 cm,马铃薯株行距与单作保持一致,具体种植模式见文献[26]。氮肥(尿素)施用分2次:基肥40%和现蕾期追肥60%。磷肥(普钙)PO75 kg·hm,钾肥(硫酸钾)KO 125 kg·hm均以基肥施入。马铃薯和玉米每年种植1季,每年的4月种植马铃薯,5月播种玉米,8月为马铃薯收获期,10月为玉米收获期。收获后,玉米去除地上部秸秆,而马铃薯地上部茎和叶覆盖在土壤表面。玉米和马铃薯生长期间实行人工管理,马铃薯播种后视土壤墒情适当进行灌溉保障出苗,整个生育期的田间管理各处理保持一致。

1.2 土壤和植株样品的采集与分析

采用五点取样法,在2020年8月马铃薯收获后玉米收获前期采集0～20 cm深的非根际土壤,马铃薯单作和间作种植均采集马铃薯种植条带内的土壤样品,每个小区随机采集5个点混合得到一个土壤样品,每个小区3次重复。采集样品一部分立即在-4 ℃保存,用于土壤微生物功能多样性、铵态氮(NH-N)、硝态氮(NO-N)和土壤含水量的测定; 另一部分风干、过筛后,用于pH、速效磷(available P,AP)、速效钾(available K,AK)、全氮(total N,TN)、碱解氮(alkali-hydrolyzable nitrogen)和土壤有机碳(soil organic carbon,SOC)的测定。

土壤微生物碳代谢功能采用Biolog-Eco微平板法测定:称取10 g的新鲜土样,并加入90 mL已灭菌0.85%的NaCl溶液于250 mL的三角瓶中,振荡30 min。取150 μL稀释1000倍的土壤稀释液接种到Biolog-Eco微平板中,将接种好的微平板置于25 ℃的恒温培养箱中培养240 h,每隔24 h在酶标仪(SpectraMax M5,美国MD)上读取1次590 nm下的光密度值。

土壤基本理化性质按照《土壤农化分析》的方法测定:土壤温度用插入式探针测温仪在采样时原位测定0～20 cm的土层温度,马铃薯单作和间作均测定马铃薯种植条带内的土壤温度,每个小区测定3次重复; 土壤含水量采用烘干法测定; pH采用1∶2.5的土水比测定; 速效磷(AP)采用碳酸氢钠浸提-比色法测定; 土壤速效钾采用醋酸铵浸提-火焰光度法测定; 全氮采用凯氏定氮法测定; 土壤硝态氮和铵态氮用1 mol·L的KCl浸提后,用连续流动分析仪(AA3全自动连续流动分析仪,SEALAnalitical,德国)测定; 土壤溶解性有机碳(DOC)用去离子水提取后(水土比 5∶1),用总有机碳分析仪(Multi-N/C 2100,Analytik Jena AG,德国)测定; 土壤有机碳(SOC)用重铬酸钾外加热法测定。

在马铃薯植株枯萎前立即采集马铃薯根及地上部茎和叶,用水清洗、烘干后,称重以测定生物量。在每个小区,收获两行新鲜马铃薯块茎,并称重,计算单位面积的马铃薯产量。

1.3 数据处理与分析

采用平均颜色变化率(average well color development,AWCD)表征土壤微生物群落的整体代谢活性,计算公式如下:

随着物质产品需求的不断增加，目前市场上的消费者也有了更多的选择。企业在发展的过程中，不仅要加强创新，也要注意创造出更加有鲜明特色的品牌产品，从而吸引消费者的注意。随着市场竞争的不断变化，企业必须要重视人的需求。企业采用柔性管理的模式，可以提高企业的竞争力，同时也可以结合市场的实际需求，确定合理的订单数量，减少企业的库存，柔性管理更适合在多品种和小批量上应用。柔性管理的模式符合企业更新换代的需求，可以获得更多消费者的信赖和支持。

式中:C为各反应孔在590 nm下的光密度值,为对照孔(水)的光密度值,C-小于0的孔中记为零,31是碳源数量。

因为168 h后的AWCD比较稳定,所以选择培养168 h后的吸光值计算Shannon指数()和Simpson指数()作为土壤微生物多样性指标和后续分析(图1)。

土壤多样性指标计算如下:

式中:P表示在590 nm下第孔的相对吸光值与所有整个微平板的相对吸光值总和的比值。

采用SPSS 20.0软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)进行不同处理间的差异显著性分析和 Duncan法进行多重比较(＜0.05)。采用CANOCO 5.0进行主成分分析(PCA)。并用R 4.0.2进行置换多元方差分析(PERMANOVA)和Mantel检验。采用Cytoscape 3.7.2完成相关性网络的构建和平均聚类系数(average clustering coefficients,ACC)的统计。其余数据作图采用Origin 2018完成。

2 结果与分析

2.1 施氮和间作对土壤性状、马铃薯产量和生物量的影响

施氮显著提高了土壤有机碳(SOC)、硝态氮和铵态氮的含量(＜0.05),但对pH没有显著影响(表1)。另外,施氮提高了土壤温度和湿度,但仅在N1处理时达到显著水平(＜0.05)。在N0处理下,马铃薯间作种植土壤的SOC含量显著高于单作(＜0.05)。两种种植模式下,与N0处理相比,施氮均显著提高了马铃薯产量、根系生物量和总生物量(＜0.05)(图1)。N1处理下,单作马铃薯的产量和总生物量显著高于间作(＜0.05)。大多数情况下,马铃薯单作和间作种植土壤的理化性状和马铃薯生物量差异并不显著。

图1 不同施氮水平下单作(MP)和间作(IP)马铃薯的产量、根系生物量和总生物量Fig.1 Yield,root biomass and total biomass of mono- (MP)and inter-cropped (IP)potato under different nitrogen application levels

表1 不同氮水平下马铃薯单作(MP)和间作(IP)土壤的理化性状Table 1 Soil physicochemical properties of mono- (MP)and inter-cropped (IP)potato under different nitrogen application levels

2.2 施氮和间作对土壤微生物代谢活性(AWCD)的影响

在整个培养过程中,各处理的AWCD值在24～168 h快速增加,168 h后趋于稳定(图2)。施氮提高了土壤微生物的AWCD值,两种种植模式AWCD值随施氮量的变化均遵循:N1＞N2＞N3＞N0的趋势。在168 h稳定后,AWCD值受施氮量和种植模式的显著影响(＜0.001),但二者交互作用的影响并不显著(表2)。施氮显著提高了AWCD值,马铃薯单作和间作土壤中分别提高58.1%～100.2%和32.1%～59.3%,并在N1处理达最大值,显著高于其他施氮处理(N2和N3)(＜0.05)(图3)。在同一氮水平下,与单作相比,间作提高了AWCD值,但仅在N0时达显著,平均提高44.8% (＜0.05)。

图2 不同氮水平下单作(MP)和间作(IP)马铃薯种植土壤微生物代谢活性(AWCD值)的动态变化Fig.2 Dynamic changes of metabolic activity (AWCD values)in mono- (MP)and inter-cropped (IP)potato soils under different nitrogen application levels

表2 不同氮水平下马铃薯单作和间作种植土壤微生物AWCD值和多样性指数的多因素方差分析Table 2 Multivariate analysis on AWCD value and diversity indexes of soil microorganism in potato mono- and inter-cropping system under different nitrogen application levels

与总AWCD值类似,施氮提高了6类碳源的AWCD值,随氮肥施用量的增加呈先增后降的趋势(图4)。其中,单作土壤中与N0处理相比,施氮后均在N1处理达显著水平。而间作土壤中,施氮显著提高了除酚类化合物外所有碳源的AWCD值,酚类在N1和N2处理达显著水平(＜0.01)。同一施氮处理下,间作后碳水化合物、氨基酸、羧酸和聚合物的AWCD值在N0处理时显著高于单作。另外在N1处理,间作土壤中碳水化合物、胺类和酚类化合物的AWCD值显著高于单作(＜0.01)。

图4 不同氮水平下单作(MP)和间作(IP)马铃薯土壤中6类碳源AWCD值变化的热图Fig.4 Heat map of AWCD values of varied carbon sources in mono- (MP)and inter-cropped (IP)potato soils under different nitrogen application levels

2.3 施氮和间作对土壤微生物群落多样性的影响

与N0处理相比,两种种植模式的Simpson指数均在N1处理最大,继续增施氮肥(N2和N3处理)后反而降低(图3)。但是,施氮后仅在单作土壤中,Simpson指数显著提高14.8%～19.2% (＜0.05),间作土壤中施氮后均未达显著水平。与单作相比,间作在N0处理时Simpson指数显著提高12.9% (＜0.05),施氮后差异不显著。

与Simpson指数类似,Shannon指数随施氮量的增加呈先增后降的趋势(图3)。同种种植模式下，与N0处理相比，施氮提高了微生物的Shannon指数,并在N1处理达到最大值。与N0处理相比,N1处理在单作和间作土壤中Shannon指数分别显著提高6.4%和7.1% (＜0.05)。与N0处理相比,施氮后,马铃薯间作土壤中Shannon指数显著提高3.3%～7.1%(＜0.05); 但单作仅在N1处理显著提高(＜0.05)。在相同施氮处理下,间作的Shannon指数均高于单作,但是仅在N0处理下显著提高2.5% (＜0.05)。

图3 不同氮水平下单作(MP)和间作(IP)马铃薯土壤的AWCD值和微生物多功能性指数Fig.3 AWCD values and indexes of soil microbial functional diversity in mono- (MP)and inter-cropped (IP)potato soils under different nitrogen application levels

2.4 施氮和间作对不同碳源利用的影响

主成分分析(PCA)表明,6类碳源的分布在不同施氮水平间均存在显著差异,种植模式间差异不显著,但二者的交互作用下存在显著差异(＜0.001)(图5)。比较不同处理中6类碳源的利用率,发现所有处理中的土壤微生物群都能够利用6类碳源(图6)。其中碳水化合物和羧酸的利用率最高。在单作土壤中碳水化合物和羧酸利用率平均分别为14.7%和9.4%; 间作土壤中碳水化合物和羧酸利用率平均分别为12.2%和7.5%。在单作土壤中,施氮增加了除碳水化合物外所有碳源的利用率。在间作土壤中施氮增加了微生物对聚合物、胺类和酚类化合物的利用率,但降低了对碳水化合物类、氨基酸和羧酸的利用率。不同种植模式间差异不显著。

图5 不同氮水平下单作(MP)和间作(IP)马铃薯土壤中不同碳源的主成分分析Fig.5 Principal component analysis (PCA)of varied carbon sources in mono- (MP)and inter-cropped (IP)potato soils under different nitrogen application levels

图6 不同氮水平下单作(MP)和间作(IP)马铃薯土壤中6类碳源利用的相对比例Fig.6 Relative proportions of six carbon sources utilization in mono- (MP)and inter-cropped (IP)potato soils under different nitrogen application levels

2.5 不同碳源与土壤环境因子和马铃薯生物量的关系

Mantel分析表明,马铃薯单作种植土壤中,土壤温度、含水量和土壤有机碳含量是显著影响AWCD值和微生物功能多样性指数(Simpson和Shannon指数)的主要环境因子(＜0.01)(图7)。同样地,间作土壤中,微生物功能多样性指数受土壤含水量(＜0.01)、温度和SOC含量(＜0.05)的显著影响。而间作土壤的AWCD值除受上述主要环境因子的显著影响外(＜0.01),还受铵态氮含量的影响(＜0.05)。另外,两种种植模式土壤中AWCD微生物功能多样性指数均受马铃薯根系生物量和总生物量的显著影响(＜0.01)。

图7 单作(MP)和间作(IP)马铃薯土壤微生物的AWCD值和功能多样性性指数(Simpson和Shannon指数)与土壤环境因子和马铃薯生物量的关系Fig.7 Relationships between the microbial AWCD value and functional diversity indexes (Simpson and Shannon indexes)with soil environmental factors and potato biomass in mono- (MP)and inter-cropped (IP)potato soils

为降低网络的复杂性,选取上述主要环境因子进行相关网络分析(图8),发现马铃薯单作种植土壤中土壤温度、含水量和土壤有机碳含量与6类碳源呈显著的正相关关系(＜0.05)。同样,马铃薯间作种植土壤中土壤温度、含水量和土壤有机碳含量与6类碳源的代谢活性同样呈显著的正相关关系。但铵态氮与胺类、聚合物和酚类化合物呈显著的正相关关系,与羧酸的代谢活性呈显著的负相关关系(＜0.05)。另外,ACC值在单作土壤(0.930)中比间作土壤(0.907)更高。

图8 马铃薯单作(MP)和间作(IP)种植土壤中主要环境因子与不同碳源的相关性网络Fig.8 Correlation networks between major environmental factors and varied carbon groups in mono- (MP)and inter-cropped (IP)potato soils

3 讨论

3.1 施氮对土壤微生物群落碳源代谢功能和多样性的影响

本研究中,与N0相比,施氮后AWCD值提高32.1%～100.2% (＜0.05),同时提高了6大类碳源的AWCD值(图3,图4)。表明施氮提高了土壤微生物对所有碳源的代谢活性。之前在热带森林中的研究也发现,施氮显著提高了植物的地上部生物量,进而提高了土壤微生物的代谢活性。一方面,施氮通过减轻植物生长的养分限制来提高初级生产力,导致更多的地上凋落物和地下根系分泌物等有机物归还到土壤,而微生物代谢活性随凋落物含量的增加而增加。另一方面,施氮降低了光合产物的碳氮比,使有机底物更容易被土壤微生物所利用,从而提高了微生物对不同碳源的代谢活性。

当施氮量从N1 (62.5 kg·hm)增加到N2 (125 kg·hm)和N3 (187.5 kg·hm)时,土壤微生物的代谢活性降低,即氮对微生物代谢活性的促进作用因过量施氮而削弱(图3,图4)。类似地,对种植油菜()土壤施氮244.6 kg·hm后,反而降低了土壤微生物的代谢活性。施氮对土壤微生物代谢活性的影响存在剂量效应。我们之前的研究表明,种植马铃薯土壤中,当施氮量为62.5 kg·hm时,马铃薯的地上部生物量和地下根系生物量最高,增加氮肥施用量(N2和N3)生物量反而降低。这与本研究的结果相同(图1)。因此,施氮过量后归还有机物数量的减少是导致土壤微生物代谢活性降低的主要原因。

Simpson指数和Shannon指数是反映土壤微生物多样性的主要指标。与AWCD值随施氮量的变化趋势相同,Simpson指数和Shannon指数也遵循N1＞N2＞N3＞N0的趋势(图3)。与Luo等在高寒草地连续施氮的研究结果类似,高氮处理土壤微生物的Shannon指数显著低于低氮处理。这可能是因为过量的氮素输入导致土壤养分失衡,抑制了植物的生长,进而导致归还的地上部有机物和地下根系分泌物的减少。另外,本研究中,当施氮量≥62.5 kg·hm(N2和N3处理),土壤硝态氮含量显著降低(＜0.05)(表1)。已有研究表明,过量施氮会加剧土壤硝态氮的淋失,降低土壤氮素的有效性,抑制旱地土壤微生物的繁殖。综上所述,当氮素供应过多后,由于归还有机物的减少和氮素有效性的降低,最终导致了地下土壤微生物代谢活性和多样性的降低。这表明合理的施氮量对提高土壤微生物代谢活性和多样性至关重要。

3.2 间作对土壤微生物群落碳源代谢功能和多样性的影响

相同施氮量下,间作提高了土壤微生物的AWCD值、Shannon指数和Simpson指数(图3),表明间作提高了土壤微生物的代谢活性和功能多样性。但在本研究中,马铃薯处于间作系统中的劣势生态位,地上凋落物和地下根系生物量都显著低于单作。这暗示间作后地下土壤微生物代谢功能多样性的提高并不是地上归还有机物数量的增加造成的。同时,大量的研究表明,间作可以改善土壤的理化性状,为微生物提供更有利的生存环境。已有研究证实,间作后土壤温度和土壤含水量提高。同时，在本研究中地下土壤微生物代谢活性和多样性与土壤温度、含水量和SOC含量显著正相关(图7)。另外间作系统中,玉米凋落物持续不断地输入,在提高SOC含量的同时,也增加了SOC中稳定碳源的相对含量。因此本研究中间作土壤微生物通过提高对聚合物类、胺类和酚类化合物的利用率,增加了土壤微生物的代谢功能多样性(图6)。综上所述,间作后微生物代谢功能多样性的增加可能与土壤温度、含水量和SOC质量及含量的提高有关。

值得注意的是,单作和间作马铃薯种植土壤中微生物的代谢活性和多样性仅在不施氮处理中存在显著差异(＜0.05),施氮后差异均不显著(图3)。这可能是因为在不施氮处理中,相比单作,马铃薯与玉米间作丰富了输入有机物的数量和多样性,从而显著提高了土壤微生物的代谢活性和功能多样性。但是,马铃薯与玉米间作的种植系统中,由于马铃薯处在养分竞争的劣势生态位,施氮后间作归还土壤的有机物数量显著低于单作(图1),弱化了间作多样性种植系统的促进作用,导致马铃薯单作和间作种植土壤微生物代谢活性和功能多样性的差异并不显著。其次,本研究发现土壤铵态氮含量只在间作土壤中与微生物代谢活性呈显著相关,并与胺类、聚合物和酚类化合物的代谢活性呈显著正相关关系(图7和图8)。同时,施氮会抑制微生物对胺类、聚合物和酚类化合物等稳定碳源的降解。但是,与单作马铃薯相比,间作后微生物可降解的有机底物减少,导致了氮素的累积,加剧了反硝化作用,大量的氮素以铵态氮的形式挥发损失。因此间作后促进了土壤微生物对稳定碳源的降解。综上所述,施氮对马铃薯种植土壤中微生物代谢活性和功能多样性的影响大于间作,同时间作的促进作用也受施氮量的显著调控。

另外,我们观察到单作网络的ACC值(0.930)略高于间作网络(0.907)(图8)。更高的ACC值表示生态系统更强的稳定性和生态网络中土壤环境与微生物间更紧密的联系。因此,与单作相比,间作马铃薯种植后反而削弱了土壤微生物碳源代谢系统原有的稳定性,使微生物碳代谢过程对土壤养分的变化更敏感,弱化了间作优势,导致单作和间作之间微生物的代谢活性和多样性的差异并不显著。其次,这可能与输入的混合凋落物物种间较大的性状差异有关。玉米凋落物中更多的难降解碳源和更低的氮素含量与马铃薯凋落物形成了鲜明的对比。之前的研究已经证实,混合凋落物物种间较大性状差异,不利于难降解有机底物的分解和土壤碳的周转。这意味着合理的地上多样性种植才能实现地下土壤养分的高效利用,加快土壤的碳循环,实现农业生态系统的可持续发展。然而,我们的研究仅利用Biolog技术从碳源代谢的角度来探讨间作对土壤微生物功能多样性的影响,这存在一定的局限性,今后还需要借助高通量测序、宏基因组测序和核磁共振等技术从微生物群落结构、功能和SOC分子结构等方面进行深入分析,进一步深入阐释多样性种植系统下的微生物功能多样性。

4 结论

本研究表明,施氮和间作提高了土壤微生物的代谢活性和功能多样性。同时,施氮对6大类碳源代谢活性的影响显著高于间作种植(＜0.05)。另外,单作土壤中施氮提高了除碳水化合物外所有碳源的利用率,但间作土壤中施氮则提高了稳定碳源(胺类、聚合物和酚类化合物)的利用率,降低了活性碳源的利用率(碳水化合物、羧酸和氨基酸)。本研究的两种种植模式中,土壤微生物代谢活性和多样性受土壤温度、含水量和SOC含量的显著影响,但铵态氮含量仅与间作土壤微生物的代谢活性显著相关。由于施氮后,间作土壤中归还有机物的数量低于单作,并且氮素的有效性降低,最终导致间作优势被进一步削弱。本研究结果进一步阐明氮素调控下,地上多样性种植系统中地下土壤微生物对碳周转和利用的作用机制。