半夏等15种常见中草药提取物的抗氧化能力比较研究

丰丕雪 易弋 黄锦翔 严寅珲 马振花 朱敦朝 赵早亚

摘  要：采用体外抗氧化实验，包括DPPH/超氧阴离子/羟自由基清除率、Fe2+螯合能力和总还原力的检测，对半夏等15种中草药水提物和醇提物的抗氧化能力进行研究，并对其综合抗氧化能力进行评价。结果表明，在不同的检测方法下，同一中草药的同种提取物会有不同的抗氧化能力，例如青果的水提物对于Fe2+螯合能力最强，螯合率达到了149.27%;而超氧阴离子自由基清除率仅为阳性对照物的55.20%;对不同中草药抗氧化能力进行综合评价，发现同一中草药的水提物和醇提物的抗氧化效果不同，水提物抗氧化效果最好的分别是青果、丹参、薄荷，醇提物抗氧化效果最好的分别是青果、花椒、桑寄生;综合水提物与醇提物的结果，发现抗氧化能力最强的3种中草药分别为青果、薄荷、丹参。上述结果说明，青果、丹参和薄荷具有良好的抗氧化性能，可为未来挖掘新型天然抗氧化剂提供参考。

关键词：中草药;提取物;抗氧化能力;综合评价

中图分类号：R282.710.5       DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2022.03.013

0    引言

需氧型生物在细胞代谢过程中产生活性氧。活性氧的过多产生会引发一系列生化反应，破坏细胞组分，致使细胞活性降低，最终导致细胞死亡[1]。活性氧在需氧型生物体内主要包括超氧阴离子自由基以及羟自由基等[2]。使用抗氧化剂可以清除这些自由基，从而减轻生物体所受到的氧化损伤。常见的抗氧化剂按来源可以分为合成抗氧化剂和天然抗氧化剂[3-4]。目前，合成类的抗氧化剂应用广泛，但是其可能有未知的毒性，在使用方面存在限制，因此，尋找更具安全性的天然抗氧化物质成为抗氧化研究领域的热点[5]。

中草药文化有上千年的发展历史，是中华之瑰宝，也是一种历史传承。我国的中草药资源十分丰富，古代的《千金方》《本草纲目》等古籍都记载了大量的中草药。众多研究表明，很多中草药都具有天然的抗氧化特性[6-7]。随着研究的深入，也确定了中草药中抗氧化物的具体成分，如蒽醌[8]、多糖[9-10]、酚酸[11-12]以及黄酮[13-18]等。通过研究中草药的抗氧化性，进而筛选强抗氧化活性物质是发现新型天然抗氧化物的有效途径。

目前虽然很多中草药的抗氧化活性都已经被检测过，但多为单独研究某一种中草药。因为实验条件不同、检测方法不同，所以无法合理比较各种中草药抗氧化能力的强弱。本研究选择15种中草药，在同样的条件下运用5种抗氧化指标分别比较它们的水提物和醇提物的抗氧化活性，从而更加客观地评价所选中草药的抗氧化能力。

1    材料与方法

1.1    材料与试剂

本文所研究的15种中草药分别为半夏、柴胡、芡实、千年健、厚朴、牛膝、丹参、薄荷、桑寄生、鸡内金、鸡血藤、独活、钩藤、花椒和青果，采购于广西柳州某大药房。实验试剂和实验仪器分别见表1和表2。

1.2    实验方法

1.2.1    中草药浸出液的制备

水提：纯水提取，料液比1∶15，转速180 r/min，温度37 ℃，反应2 h，然后常温超声提取30 min，滤液浓缩，最后用蒸馏水定容到质量浓度为1 g/mL。

醇提：75%乙醇溶液提取，料液比1∶15，转速180 r/min，温度37 ℃，反应2 h，然后常温超声提取30 min，滤液浓缩，最后用蒸馏水定容到质量浓度为1 g/mL。

1.2.2     中草药提取物体外抗氧化能力检测

1）对DPPH自由基的清除作用

参照Kong等[19]实验方法，样品量取等体积的待测液与2×10-4  mol/L的DPPH溶液混匀;空白组用蒸馏水代替样品组中的待测液;对照组用无水乙醇代替2×10-4  mol/L的DPPH溶液。反应30 min后，在517 nm处测各组的吸光度值。以抗坏血酸为阳性对照，实验重复3次（n = 3），下同。DPPH自由基清除率计算公式如式（1）所示：

[DPPH自由基清除率=A2+A0-A1A0×100%]. （1）

式中：[A0]、[A1]、[A2]分别为空白组、样品组和对照组的吸光度值。

2）对羟自由基的清除作用

邻二氮菲-Fe2+被羟自由基氧化为邻二氮菲-Fe3+后，其在536 nm处的最大吸收峰消失[20]。参照张京芳等[21]方法，在损伤管中先加入1 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液，再依次加入2 mL 0.15 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）和1 mL蒸馏水，混匀后，加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液，再次混匀后，加入1 mL 0.01%双氧水，在37 ℃下水浴60 min;未损伤管以蒸馏水代替损伤管中加入的0.01%双氧水;样品管以1 mL样品代替损伤管中加入的蒸馏水。在536 nm处测各组的吸光度值，羟自由基清除率计算公式如式（2）所示：

[羟自由基清除率=As-ADAu-AD×100%] .    （2）

式中：[As]、[AD]、[Au]分别为样品管、损伤管和未损伤管的吸光度值。

3）对超氧阴离子自由基的清除作用

邻苯三酚可以在碱性溶液中自动氧化，生成   [·O-2]自由基和有色中间产物醌[22]。参照冯娇等[23]方法，样品组加入4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl（pH 8.2），在25 ℃下水浴20 min，再依次加入1 mL样品液和0.4 mL 25 mmol/L邻苯三酚，混匀后于25 ℃下水浴5 min，最后加入1.0 mL 8 mol/L盐酸终止反应。空白组以蒸馏水替代样液，参比是Tris-HCl。在299 nm处测定各组的吸光度，超氧阴离子自由基清除率按式（3）计算：

[超氧阴离子自由基清除率=A0-A1A0×100%]. （3）

式中：[A0]和[A1]分别为空白组和样品组的吸光度值。

4） Fe2+螯合能力的测定

羟基自由基与邻近的生物分子迅速反应，抗氧化物质对金属离子的螯合作用间接地促进了其本身具有的抗氧化活性[24]。参照马梦娇[25]的方法，样品组依次加入1 mL样品溶液、3.7 mL蒸馏水、0.1 mL 2 mmol/L 的FeCl2溶液和0.2 mL 5 mmol/L的菲洛嗪，在25 ℃下反应10 min;空白组以蒸馏水代替样品溶液，对照组以蒸馏水代替菲洛嗪溶液。在562 nm 处测定各组的吸光度值，Fe2+螯合率按式（4）计算：

[Fe2+螯合率=1-A1-A2A0×100%]  .    （4）

式中：[A0]、[A1]和[A2]分别为空白组、样品组和对照组的吸光度值。

5）总还原力的测定

抗氧化物质通过提供电子可使自由基失活，还原力越大，则抗氧化活性越强[26]。采用Gao等[27]实验方法，总体系中含有1 mL 样液，依次加入2.5 mL PBS和1 mL铁氰化钾溶液（10 g/L），振荡均匀，在50 ℃下水浴20 min，加入2 mL三氯乙酸（100 g/L）和1.2 mL三氯化铁（1 g/L）终止反应，在700 nm处测定吸光度值，相对总还原力按式（5）计算：

[相对总还原力=A1A2×100%]  .       （5）

式中：[A1]和[A2]分别为阳性样品组和对照组的吸光度值。

6）各种中草药抗氧化活性的综合评价

按水提物和醇提物分两大类，根据每种检测方法测出来的值进行排名，排名第一为15分，排名第二为14分，依次类推;对同一中草药的水提物和醇提物的分数分别求和，记为总分并统计排名。

1.3    数据处理与分析

实验数据采用SPSS26.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA analysis），采用LSD法进行多重比较分析，结果使用平均值[±]标准误差（mean±SE）表示，结果真实程度用概率[P]表示，[P]值越小，表明结果越显著。*、**、***分别表示[P<0.05]、[P<0.01]、[P<0.001]。

2    结果与分析

2.1   对DPPH自由基的清除作用

由图1可知，不同中草药提取物均具有不同程度的DPPH自由基清除能力。青果、鸡血藤、薄荷具有较强的DPPH自由基清除能力（≥ 90.00%），其中青果醇提物效果最好，清除率达到94.66%，其次是青果水提物、鸡血藤醇提物、薄荷醇提物、鸡血藤水提物，清除率分别为94.02%、92.32%、92.20%和91.49%。此外，同种中草药的水提物和醇提物在同一浓度下的DPPH自由基清除能力可能存在显著差异。例如，丹参水提物对DPPH自由基的清除能力显著（P < 0.001）强于其醇提物;而花椒醇提物显著（P < 0.001）强于其水提物。

2.2   对超氧阴离子自由基的清除作用

由图2可知，不同中草药提取物均具有不同程度的超氧阴离子自由基清除能力。青果、独活、花椒、薄荷具有较强的超氧阴离子自由基清除能力（≥ 40.00%），其中青果水提物超氧阴离子自由基清除能力最强，清除率达到54.22%;其次是独活水提物、青果醇提物、花椒醇提物、花椒水提物、薄荷水提物，清除率分别为46.68%、42.59%、42.54%、41.68%以及41.05%。此外，同种中草药的水提物和醇提物在同一浓度下的超氧阴离子自由基清除能力可能存在显著差异。例如，薄荷水提物对超氧阴离子自由基的清除能力显著（P < 0.001）强于其醇提物。

2.3   对羟自由基的清除作用

由图3可知，不同中草药提取物均具有不同程度的羟自由基的清除能力。青果、薄荷、丹参具有更强的羟自由基清除能力（≥ 40.00%），其中青果醇提物羟自由基清除能力最强，清除率达到115.26%，其次是青果水提物，羟自由基清除率是99.23%。此外，同种中草药的水提物和醇提物，在同一浓度下羟自由基清除能力可能存在显著差异。例如，丹参水提物对羟自由基的清除能力显著（P < 0.001）强于其醇提物;青果醇提物对羟自由基的清除能力显著（P < 0.001）强于其醇溶液。

2.4    对Fe2+的螯合能力

由图4可知，不同中草药提取物具有不同程度的Fe2+螯合能力。丹参、青果、千年健具有较强的Fe2+螯合能力（≥12.00%），其中丹参水提物Fe2+螯合能力最强，Fe2+螯合率达到16.88%;其次是青果水提物，Fe2+螯合率是14.33%。此外，同种中草药的水提物和醇提物在同一浓度下的羟自由基清除能力

2.5    相对总还原力

由图5可知，不同中草药提取物具有不同程度的相对總还原力。青果、鸡血藤、薄荷、丹参具有更强的总还原力，相对总还原力（≥30.00%），其中青果水提物的总还原力最强，相对总还原力达到81.82%;其次是青果醇提物，相对总还原力是71.80%。此外，同种中草药的水提物和醇提物在同一浓度下相对总还原力可能会存在显著差异。例如，丹参水提物的总还原力显著（P < 0.001）强于其醇提物;薄荷醇提物的总还原力显著（P < 0.001）强于其水提物。

2.6   15种中草药抗氧化活性综合评价

通过综合打分可以更加科学、合理地筛选出抗氧化能力较强的中草药，为今后深入挖掘天然抗氧化剂打下基础。表3为半夏等15种中草药抗氧化能力总评价表。由表3可以看出，青果综合抗氧化能力最强，总分高达147;其次是薄荷、丹参，其抗氧化能力的总分分别是109、107。

3    讨论

3.1   不同檢测方法下的抗氧化能力比较

运用不同的检测方法得到的同种中草药提取物抗氧化能力的结果有明显差异，如青果水提物对Fe2+的螯合能力（149.27%）和超氧阴离子自由基清除率（55.20%）明显不同。Fu等[28]在研究五味子中黄酮类化合物（PCF）的抗氧化活性时，发现PCF浓度为2 mg/mL时，超氧阴离子自由基的清除率达到阳性对照的97.74% ，而羟自由基的清除率仅为阳性对照的83.35%。Gao等[27]从金红菇菌丝体中提取出多糖组分GRMP1，对其进行体外抗氧化能力检测，结果显示，当GRMP1浓度为2 g/L时，对羟自由基的清除能力最强，相对于阳性对照维生素C羟自由基清除率约为96.94%，而超氧阴离子自由基清除率仅为阳性对照的38.46%。可能是由于同种中草药提取物中含有多种抗氧化成分，这些物质通过不同的机制发挥作用，从而在不同的检测方法下会有不同的结果。

3.2   水提物和醇提物抗氧化活性差异分析

本文研究结果显示，某些中草药水提物和醇提物的抗氧化活性存在明显差异。例如，丹参水提物的抗氧化能力均显著高于其醇提物，可能是因其具有抗氧化作用的活性物质大多是水溶性的。据报道，丹参中主要含有脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类化合物以及多糖等物质，水溶性的酚酸类主要有丹参素、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、紫草酸等[29-30]。这些酚酸具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗凝血和抗炎等[31]。Liang等[32]研究表明，丹参的水溶性成分丹酚酸A和丹酚酸B能够显著抑制H2O2诱导的人卵巢颗粒瘤细胞系（KGN）细胞的氧化应激反应，说明丹参水溶性成分具有抗氧化活性。Yuen等[33]试验结果也表明丹参水提取物能降低线虫体内的活性氧（ROS）水平，从而显著减缓秀丽隐杆线虫阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）模型中的瘫痪进程。除了丹参外，薄荷水提物对超氧阴离子、羟自由基的清除能力显著强于其醇提物，这与陈智坤等[34]的研究结果相似。勾明玥等[35]对多种植物采用 DPPH 法测定抗氧化活性，结果显示，鸡血藤醇提物对DPPH自由基清除率为94.00%，其水提物的清除率只有48.00%，这与本研究中鸡血藤醇提物的总还原力显著强于其水提物的结果类似，提示鸡血藤的主要抗氧化成分是醇溶的。因此，同一中草药采用不同的提取方式所获得的抗氧化成分是不一样的。

3.3    15种中草药抗氧化活性综合分析

通过综合评价可以发现，15种中草药中抗氧化能力最强的3种分别是：青果、薄荷、丹参。这3种中草药分别含有大量的抗氧化成分。如青果和丹参中含有酚酸类和黄酮类物质，薄荷中含有大量的薄荷多糖和黄酮类化合物[36]。酚酸类物质分子结构中含有酚羟基，其能够提供氢质子，具有很强的抗氧化能力[37];薄荷多糖中含有的醛酸基团能够清除超氧阴离子，羟基和氨基具有较强的超氧阴离子、羟自由基清除能力[38];黄酮类能够作为氢离子供体，进而抑制自由基的产生以及清除活性氧、活性氮[39]。这与本研究中青果、薄荷、丹参抗氧化能力强的结果是一致的。这些抗氧化物质特殊的结构使得中草药具备清除自由基与活性氧的能力，进而展现抗癌、抗菌、抗病毒作用[40]。如青果中的苦苷、酪醇、羟酪醇和马鞭草苷被证明可以预防冠状动脉疾病和癌症[40]，其中的多酚物质（橄榄苦苷和羟酪醇）的抗氧化和抗动脉粥样硬化作用已在文献中得到广泛证实[41-42]。同样地，薄荷、丹参中的黄酮类化合物也被证明具有抗氧化与抗炎作用[43-44]。本研究结果表明青果、薄荷、丹参具有良好的抗氧化作用，结合文献可以推测是由于其中含有大量的抗氧化活性物质，并发挥抗氧化、抗炎症和抗癌作用，但是其具体的药理成分还有待进一步研究。

4    结论

通过本文的研究，发现同一中草药的水/醇提物的抗氧化活性存在差异，不同检测方法下同一中草药提取物的抗氧化能力也不同，采用不同的提取方式会获得不同的抗氧化成分，抗氧化成分以及含量等的差异会导致中草药提取物产生不同的抗氧化效果。通过综合评价发现青果、丹参、薄荷具有良好的抗氧化效果，可能与这几种中草药含有较多黄酮、酚酸、多糖等强抗氧化物质有关。通过对中草药抗氧化活性的测定，能够为筛选天然抗氧化剂提供基础数据支撑，同时为寻找抗炎、抗菌或抗癌药物提供理论支持。

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Comparative study on antioxidant capacity of extracts from 15 common Chinese medicinal herbs including Ban Xia （Pinelliae rhizoma）

FENG Pixue1，2，3， YI Yi1，2，3， HUANG Jinxiang1，2，3， YAN Yinhui1，2，3， MA Zhenhua1，2，3， ZHU Dunchao1，2，3， ZHAO Zaoya*1，2，3

（1. School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources （Guangxi University of

Science and Technology）， Liuzhou 545006， China; 3. Key Laboratory of Sugar Resources Processing of

Guangxi Higher Education Institutions （Guangxi University of Science and Technology）， Liuzhou 545006， China）

Abstract： This paper investigated the antioxidant capacity of aqueous and alcoholic extracts from 15 Chinese medicinal herbs and assessed their comprehensive antioxidant capacity by performing in vitro antioxidant experiments including DPPH/ superoxide anion/hydroxyl radical scavenging rate， Fe2+     chelating capacity and total reducing power detection. The results showed that the same kind of extracts from the same Chinese medicinal herb with different detection methods would have different                   antioxidant capacities， for example， the water extract of Qing Guo （Canarii fructus） had the strongest chelating ability to Fe2+， the rate of chelating reaching 149.2%， while the superoxide anion radical          scavenging rate being only 55.20%; A comprehensive assessment of the antioxidant capacity of           different Chinese medicinal herbs revealed that aqueous and alcoholic extracts of the same Chinese herb had different antioxidant effects， and the drugs with the best antioxidant effect from aqueous       extracts were Qing Guo （Canarii fructus）， Dan Shen （Salviae miltiorrhizae Radix）， Bo He （Menthae herba）; The drugs with the best antioxidant effect of the alcoholic extract were Qing Guo （Canarii    fructus）， Hua Jiao （Zanthoxyli pericarpium） ， Sang Jisheng （Taxilli herba）; Assessing the results of aqueous and alcohol extract， we found that the three drugs with most antioxidant capacity were Qing Guo （Canarii fructus）， Bo He （Menthae herba）， Dan Shen （Salviae miltiorrhizae Radix）. The above       results show that Qing Guo （Canarii fructus）， Dan Shen （Salviae miltiorrhizae Radix） and Bo He  （Menthae herba） have good antioxidant functions， which provides a theoretical support for the development of natural antioxidants.

Key words： Chinese medicinal herbs; extract; antioxidant capacity; comprehensive assessment

（責任编辑：于艳霞）