Sp1促进A549细胞增殖、EMT、侵袭和血管生成的研究

秦书华，彭 俊，高创创，桂浩鑫，邵钰婷，郝倩，向 诚，徐天瑞，刘 莹

(1.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500；2.云南省第一人民医院 胸外科，云南 昆明 650034；3.锦州医科大学 生命科学研究院，辽宁 锦州 121001)

0 引 言

肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，居同期恶性肿瘤死亡原因之首[1].目前肺癌的治疗包括手术治疗、化学药物治疗、分子靶向治疗以及免疫治疗等，虽然目前部分市售的肺癌治疗药物疗效很明显，但易产生耐药性.因此,急需对肺癌的发病机制进行系统研究，开发新的治疗靶点.

c-Met(Hepatocyte Growth Factor Receptor，HGFR，肝细胞生长因子受体)属于受体酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinases,RTKs)超家族[2-3].c-Met在肺癌组织、肺癌细胞中被异常激活，并能够促进肺癌细胞的增殖、分化、侵袭和血管生成[4].研究表明，c-Met 的异常活化部分是被转录激活所致，在 c-Met 基因大约 2.6 kb 的启动子上存在多个顺式作用元件，可以与多种转录因子作用.

Sp1(Specificity protein 1)是一个重要的转录调控因子，包含DNA结合结构域、转录活性域和连接域等[5-6].Sp1特异地与基因启动子区的顺式作用元件GC盒(GGGGCGGGG)以及GT盒(GGTGTGGG)结合后参与了许多生物过程，如细胞增殖、分化以及肿瘤转化等[7-9].Sp1调控数以千计的编码基因，如编码细胞周期蛋白A2、p21cip1/waf1、E-钙粘蛋白和Sp1本身的编码基因[10].这些基因参与多种生理过程，如细胞周期进程和细胞迁移等.Sp1还调节非编码基因(如lncC01234、lnc00657等)的表达，促进肺癌细胞的增殖[11-12].研究表明，Sp1能够与c-Met启动子结合，但尚不明确Sp1转录调控c-Met在肿瘤生长、浸润、转移及肿瘤血管生成等过程中的作用[13].

作者通过查阅大量文献并对c-Met启动子核心序列(-297→+22)的转录因子结合位点进行分析，发现c-Met启动子核心序列包含3个Sp1转录因子的结合位点.本研究利用肺腺癌A549细胞，构建Sp1基因的过表达和沉默表达细胞模型，系统研究Sp1转录调控c-Met在A549细胞增殖、凋亡、EMT转化、侵袭和血管生成中的作用机制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

人胚肾293T细胞、人非小细胞肺癌A549细胞系和人非小细胞肺癌H1299细胞系均购于中国科学院上海细胞库，冻存于液氮中.

1.1.2 临床样本

选取云南省第一人民医院胸外科确诊的12例ⅡA期肺癌，患者年龄40～65岁，并行外科手术治疗，将肺癌组织及其癌旁组织 (距离癌组织 5 cm) 离体后立刻置于液氮中，并迅速转移至-80 ℃ 保存.所有标本均取得患者及其家属同意以及伦理委员会批准.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染

293T细胞、A549细胞或H1299细胞按照1×105/mL浓度铺于六孔板，细胞生长至70%左右，按照 lipofectamine 3000 转染试剂说明书转染过表达Sp1和shSp1质粒，转染后将各组细胞于 37 ℃ 培养箱继续培养 24 h.

1.2.2 Western blotting和实时荧光定量PCR

参照Western blotting检测蛋白表达情况的操作方法[14].

根据Trizol (Invitrogen)试剂说明书的方法操作.取 1 μL cDNA作为模板，以 18 s 作为内参.反应条件：预变性，95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、10 s，40个循环，每个循环后进行熔解曲线分析.

1.2.3 双荧光素酶报告基因检测

按照Promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作.

1.2.4 染色质免疫沉淀(ChIP)

按照Millpore染色质免疫共沉淀(ChIP)试剂盒说明书操作.

1.2.5 细胞侵袭、迁移实验和统计学分析

Transwell小室实验分别收集4组A549细胞，以无血清培养基重悬细胞制备单细胞悬液(3×104个/mL),取 500 μL 加入上室中，下室加入 750 μL 含10%胎牛血清的1 640培养基.20 h 后固定、染色，显微镜下随机选取6个视野，计数基底膜上的细胞并取均数.实验重复3次.

细胞划痕实验A549细胞按照1.5× 105个/mL，铺于6孔板，贴壁生长至约90%，弃旧培养液，用 200 μL 灭菌枪头在贴壁细胞中央划痕，洗去脱落细胞，倒置显微镜下拍照，用Image J测量并记录划痕面积，48 h 后再次拍照并测量细胞划痕面积，计算划痕愈合率.

2 结果

2.1 转录因子Sp1能够与c-Met基因启动子结合

首先，选取12对人源肺癌及癌旁组织样本，提取总蛋白，Western-blotting检测Sp1和c-Met蛋白的表达情况，结果表明，与癌旁正常组织相比，Sp1和c-Met在肺癌组织样本均呈现高表达，且差异具有统计学意义(见图1a).

进一步地，采用双荧光素酶报告基因检测法，将过表达Sp1的双荧光素酶报告基因载体与c-Met启动子核心区域的载体共转染至HEK293T细胞，观察荧光素酶活性的改变.结果显示，与单独转染c-Met promoter-pGL3组相比，共转染pCMV-myc-Sp1和c-Met promoter-pGL3组荧光活性显著增加(>1.5倍)，差异具有统计学意义，表明Sp1对c-Met基因有直接调控作用(见图1b).

收集A549细胞，按照Millipore ChIP 试剂盒操作程序进行实验.Input做为阳性对照，阴性对照组为不加抗体组.结果显示，与阴性对照组相比，Sp1能够结合在c-Met启动子的核心区域(-350→+60)(见图1c).

图1 转录因子Sp1能够与c-Met基因的启动子结合Fig.1 The transcription factor Sp1 can bind to the promoter of the c-Met gene:(a)Western blot detection of Sp1 and c-Met expression in lung cancer and paraneoplastic tissues;(b)Dual luciferase reporter gene assay shows that Sp1 can bind to the c-Met gene promoter;(c)ChIP experiments show that Sp1 can bind to the c-Met gene promoter

2.2 转录因子Sp1能够正向调控c-Met基因的表达

为了进一步检测Sp1和c-Met之间的调控关系，分别在A549细胞和H1299细胞中考察过表达和沉默表达Sp1对c-Met基因表达的影响.结果表明，在A549(见图2a-b)和H1299细胞(见图2c-d)中，过表达Sp1促进c-Met的蛋白表达和mRNA表达，而沉默表达Sp1抑制c-Met的蛋白表达和mRNA表达.以上结果表明Sp1是c-Met的正向转录调控因子.

图2 Sp1能够转录调节c-Met的表达Fig.2 Sp1 can transcriptionally regulate the expression of c-Met expression：(a)Sp1 regulates protein expression of c-Met in A549 cells;(b) Sp1 regulates mRNA expression of c-Met in A549 cells;(c)Sp1 regulates protein expression of c-Met in H1299 cells;(d) Sp1 regulates mRNA expression of c-Met in H1299 cells

2.3 Sp1转录调控c-Met能够促进A549细胞增殖和抑制A549细胞凋亡

当凋亡发生时，细胞会皱缩、变圆，并形成凋亡小体.倒置相差显微镜观察发现，过表达Sp1抑制，沉默表达Sp1促进细胞发生凋亡(见图3a).进一步用Hochest33342染色，荧光显微镜观察发现，过表达Sp1抑制，沉默表达Sp1促进细胞核内染色质固缩，DNA发生降解和断裂，并呈现出致密的染色质浓染(见图3a).

由于c-Met在肿瘤特别是肺癌中呈现高表达，c-Met介导的肿瘤发生过程主要介导下游RAF/MEK/ERK 通路，因此，本文检测了过表达和沉默表达Sp1对ERK 激活的影响.结果表明，过表达Sp1促进ERK激活，而沉默表达Sp1抑制ERK激活(见图3b).此外，过表达Sp1促进，而沉默表达Sp1抑制c-Met的表达和激活，以及增殖相关蛋白Ki67的表达；并且过表达Sp1抑制，而沉默表达Sp1促进凋亡相关蛋白Caspase-3的剪切.以上结果表明Sp1转录调控c-Met，促进下游RAF/MEK/ERK通路的激活，促进A549细胞增殖和抑制A549细胞凋亡，进而促进肿瘤的发生.

图3 Sp1对c-Met的转录调控能够促进A549细胞增殖，抑制A549细胞凋亡Fig.3 Sp1 transcriptional regulation of c-Met can promote A549 cell proliferation and inhibit A549 cell apoptosis：(a)Effect of Sp1 overexpression or silent expression on apoptosis in A549 cells by phase contrast microscopy or fluorescence microscopy;(b) Effect of Sp1 overexpression or silent expression onthe expression of proliferation-associated proteins and apoptosis-associated proteins in A549 cells

2.4 Sp1转录调控c-Met能够促进A549细胞上皮间质转化

推测转录调控c-Met能够影响肿瘤的发生过程.上皮-间质转化是上皮细胞获得迁移能力的方式之一.首先，检测过表达和沉默表达Sp1转录调控c-Met在EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)转化中的作用.

采用倒置荧光显微镜观察Sp1对A549细胞EMT转化的影响.形态学观察结果显示，过表达Sp1显著促进而沉默表达Sp1显著抑制A549细胞由多角形的上皮细胞向纤维状间充质细胞转化(见图4a).

进一步采用Western-blot和荧光定量PCR(Q-PCR)法检测EMT过程中相关因子的蛋白表达和mRNA表达情况.结果显示，过表达Sp1促进而沉默表达Sp1抑制EMT转化过程中特异性标志物波形蛋白(vimentin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)的蛋白表达(见图4b)和mRNA表达(见图4c).此外，过表达Sp1抑制而沉默表达Sp1促进EMT转化过程中E-钙粘蛋白(E-cadherin)的蛋白表达(见图4b)和mRNA表达(见图4c).以上结果表明，Sp1转录调控c-Met能够促进A549细胞发生EMT转化.

图4 Sp1对c-Met的转录调控能够促进A549细胞EMT转化Fig.4 Sp1 transcriptional regulation of c-Met can promote A549 cell EMT transformation:(a)Morphological changes induced by Sp1 overexpression or silent expression during EMT transformation of A549 cells;(b)Protein expression;(c)mRNA expression

2.5 Sp1转录调控c-Met能够促进A549细胞侵袭和血管生成

48 h 细胞划痕实验中，过表达Sp1组愈合率(78.21±7.06)显著高于空载体组(40.31±7.7).同时沉默表达Sp1组愈合率(17.76±4.91)显著低于空载体组(46.08±5.37)(见图5a-b).Transwell侵袭实验结果显示，过表达Sp1组侵袭力为(127.67±19.43)个，显著高于空载体组(62.33±4.73)个；同时沉默表达Sp1组侵袭力为(37.67±19.43)个，显著低于空载体组(68.67±4.16)个(见图5c-d).

采用Q-PCR法检测侵袭、迁移相关基因的表达.结果显示，过表达Sp1促进而沉默表达Sp1抑制侵袭、迁移相关因子β-连环蛋白(β-catenin)、粘着斑激酶(FAK)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的mRNA表达(见图5e).

血管生成是c-Met介导肿瘤发生过程中一个重要的过程.血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)和环氧合酶-II(COX-2)是血管生成过程中重要的调控因子，因此，本文采用Westen-blot和Q-PCR法检测Sp1转录调控c-Met对血管生成的影响.结果显示，过表达Sp1促进而沉默表达Sp1抑制血管生成关键因子COX-2的蛋白表达(见图5f)和mRNA表达(见图5g).此外，Q-PCR检测结果表明，过表达Sp1促进而沉默表达Sp1抑制VEGF和CTGF的mRNA表达(见图5g).以上结果表明，Sp1转录调控c-Met促进肿瘤的发生主要通过促进c-Met诱导的A549细胞侵袭、迁移和血管生成过程.

图5 Sp1对c-Met的转录调控能够促进A549细胞的侵袭和血管生成Fig.5 Sp1 transcriptional regulation of c-Met can promote migration,invasion,and angiogenesis in A549 cells：(a)Scratch assay to detect the effect of Sp1 overexpression or silent expression on the invasion and migration of A549 cells;(b)Scratch test bar chart;(c)Transwell assay to detect the effect of Sp1 overexpression or silent expression on the invasion and migration of A549 cells;(d)Transwell bar chart;(e)Effect of overexpression or silencing of Sp1 expression on invasion and migration-related gene expression by fluorescent quantitative PCR;(f)Western blotting for COX-2 expression;(g) Detection of angiogenesis-related genes COX-2,VEGF and CTGF by fluorescent quantitative PCR

3 讨 论

c-Met处于HGF/c-Met信号转导通路的核心位置，其上游调控因子通过抑制c-Met的表达或激活特异性抑制肿瘤细胞中c-Met的异常激活.在 c-Met 基因启动子核心序列存在3个Sp1转录因子的结合位点.Sp1在多种组织中表达，同时调控细胞生长进程[15].例如Sp1刺激lnc00657通过靶向miR-26b-5p/COMMD8轴促进非小细胞肺癌(NSCLC)的发生发展[12]，Sp1亦可通过lnc01234调节miR-140来调节OTUB1表达，从而促进肺癌细胞的进程.

HGF/c-Met信号转导刺激癌细胞的形态发生，通过EMT获得这些侵袭的表型[16].抑制COX-2能够抑制Akt/c-Met驱动的COX-2/Akt/FASN级联反应，推迟了癌症的发生，c-Met还能够通过c-Met-NF-κB-COX-2增加癌细胞的增殖和迁移能力，通过c-Met-Bcl-2-caspase-3通路，增强下游效应并拮抗冬凌草甲素诱导的A549细胞凋亡[8,17-19].

本研究着眼于Sp1转录因子在c-Met通路中的调控作用.Sp1和c-Met在肺癌组织中均呈现出高表达，而正常组织中较少，并且c-Met与Sp1表达在蛋白水平和mRNA水平呈正相关.双荧光素酶报告基因法检测和染色质免疫共沉淀(ChIP)法研究发现Sp1对c-Met基因有直接调控作用.本文的研究证明，对于Sp1能够促进癌细胞的增殖、间质转化、血管生成，可能是通过转录调控c-Met的表达和激活实现的.

4 结 论

综上所述，Sp1和c-Met在肺癌组织中均呈现出高表达，而正常组织中较少.在肺癌A549细胞中，转录因子Sp1能够与c-Met基因启动子核心序列区结合，促进c-Met的蛋白表达和mRNA的表达.在A549细胞中，Sp1转录调控c-Met能够促进细胞增殖、上皮间质转化、侵袭以及血管生成，抑制细胞凋亡的发生.