饲料蛋白质水平对大鳞鲃氨基酸沉积率及甲状腺激素的影响

2022-07-07刘思源王常安王亚玲张树泽陆绍霞刘红柏

江西农业大学学报 2022年3期

刘思源，王常安，王亚玲，张树泽，陆绍霞，刘红柏

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江哈尔滨 150070；2.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连 116000；3.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；4.东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨 150070）

【研究意义】大鳞鲃（Barbus capito）属于鲤科（Cyprinidae）、亮鲃属（Luciobarbus），是乌兹别克斯坦当地名贵的大型经济鱼类之一，自2003 年引进我国。大鳞鲃作为杂食性鱼类，食性广、生长速度快[1]。目前，已在我国辽宁、河北、山东、天津、四川、江苏、广东等地和一些内陆的盐碱地进行了推广养殖，均取得了良好的经济效益[2]。为进一步研究其高效专用的配合饲料，需要对其营养需求进行深入研究。蛋白质作为水生动物最主要的营养来源，需要降解为必需和非必需的氨基酸和小肽，才能促进鱼体发育、维持免疫功能、调节鱼体的代谢功能[3]。若饲料蛋白含量不足，会导致鱼体的生长受限和饲料效率降低。饲料蛋白含量过高，氨基酸组成失衡，不仅造成蛋白质资源浪费，还会导致粪便和残饵等引起的水质恶化现象[4-5]。当饲料中的氨基酸达到平衡时，鱼体对饲料氨基酸能够充分利用，从而显著提高生长性能。【前人研究进展】有研究发现，当饲料蛋白添加低于鱼类营养需求时，饲料的氨基酸用于维持鱼类正常的生理代谢，有部分积累，鱼体氨基酸沉积量受蛋白质水平影响显著；而当饲料蛋白添加高于鱼类需求时，参与正常生理代谢的蛋白质已得到满足，鱼体氨基酸沉积量趋于稳定，故不受饲料蛋白水平影响[6-7]。在张静等[8]对工业养殖大菱鲆（Scophthatmus maximusL.）幼鱼的研究中有相似的发现，随着饲料蛋白水平的升高，鱼体肌肉氨基酸略有增加，但当饲料蛋白水平高于50%时，肌肉氨基酸积累趋缓[8]。Barreto-Curiel等[9]在不同蛋白水平下的蛋白质利用进行研究表明，40%蛋白水平下加利福尼亚湾石首鱼（Totoaba macdonaldi）幼鱼鱼体的蛋白沉积率最高，43%处理组的肌肉中必需氨基酸富集显著。另外，多项研究[10-11]表明，饲料蛋白质能够影响甲状腺功能，通过调控甲状腺轴，刺激甲状腺激素分泌，进而促进鱼体生长。Eales 等[12]认为，三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine，T3）水平的适度提高，可增加细胞内骨骼肌蛋白质合成相关mRNA 含量，促进鱼体对氨基酸的吸收，增强鱼体蛋白质的合成与积累。【本研究切入点】此前，国内外学者通常从生长性能、饲料转化、营养物质利用等方面来确认水生生物适宜的日粮蛋白水平。Yan等[13]以特定生长率为评价标准，研究得到点带石斑幼鱼（Epinephelus coioides）的最适饲料蛋白添加量为521.84 g/kg。王常安等[14]分别以大鳞鲃幼鱼的增重率和饲料系数为评价指标，确定大鳞鲃幼鱼的最适饲料蛋白水平为43.09%和44.15%。许红等[15]根据大鳞鲃鱼体日增加氨基酸和日维持氨基酸需要量两者之和，得到大鳞鲃（初重（11.29±0.07）g）饲料中9 种必需氨基酸的最低含量。有关大鳞鲃对蛋白质、脂肪[16]、氨基酸[15]等营养素的需要量已确定，但关于大鳞鲃对饲料氨基酸组成及利用关系无相关研究。【拟解决的关键问题】试验研究饲料蛋白质水平对鱼体氨基酸组成、沉积率及血清T3、thyroxine（T4）含量的影响，以鱼体氨基酸沉积率为指标确定满足大鳞鲃幼鱼有效利用饲料中蛋白质的范围，为配制大鳞鲃饲料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

试验饲料用酪蛋白、鱼粉和小麦水解蛋白为蛋白源，鱼油、豆油和磷脂为脂肪源，以糊精平衡能量。设计7 组不同蛋白水平饲料，含量分别为30.24%（G1），33.22%（G2），36.23%（G3），39.33%（G4），42.15%（G5），45.33%（G6）和48.12%（G7），配方及营养水平见表1[14]，氨基酸组成见表2。原料均过80 目筛后用鼓型混合机混合，膨化制粒（直径为1.5 mm），然后置于-20 ℃冰箱中保存待用。

表1 基础饲料配方及营养水平（风干基础）Tab.1 Dietary formula and nutritional level（air-dry basis） %

表2 试验饲料氨基酸组成及含量Tab.2 Amino acid profiles in the test diets %

1.2 试验鱼

试验鱼来自中国水产科学研究院鲟鱼繁育技术中心，日龄70 d，初重为（11.07±2.42）g。选取鱼体健康、规格一致的630尾大鳞鲃幼鱼放入室内循环水养殖系统。用基础饲料驯养14 d后开展养殖试验。

1.3 饲喂与管理

试验分7 个处理组，每处理3 个重复，每重复30 尾鱼。试验位于中国水产科学研究院黑龙江水产研究所第一车间，在玻璃缸水族箱（220 L）循环水系统中进行。试验水为曝气水，水温（25.0±0.5）℃，溶氧＞6.0 mg/L，NH4+-N＜0.2 mg/L，pH值7.5～7.8，NO2--N＜0.1 mg/L，日换水量为全水量1/3。光照周期12 L∶12 D。日投喂4次（08：00，11：00，13：00，16：00），饱食投喂。养殖周期为56 d。

1.4 样品采集

每个重复取6 尾全鱼，置于20 ℃冰箱中保存待测。另取3 尾鱼麻醉后抽取尾静脉血，4 ℃静置30 min，4 500 r/min 离心15 min后取上层血清，装入1.5 mL离心管中，置于-80 ℃冰箱冻存，待用于T3、T4含量测定。

1.5 氨基酸组成测定

将置于-20 ℃冰箱的全鱼解冻后，于电热恒温干燥箱中70 ℃下烘干后，称量测定干物质含量。利用磨粉机将烘干后鱼体研成鱼粉，用索氏抽提法脱脂后待用于氨基酸测定。依据GB/T 50091124—2003以酸水解法，称取40～50 mg 烘干脱脂后鱼粉放入50 mL 安培瓶中并做好标记，加入6 mol/L 盐酸10 mL，封管后放入恒温干燥箱箱（110±1）℃中水解22 h，冷却后打开安瓿瓶；加入6 mol/L 的氢氧化钠溶液10 mL调节PH值，最后用0.02 mol/L的盐酸定容至100 mL，充分混匀后即为试样水解液。吸取试样水解液及混合氨基酸标准液1 mL，经过滤至动进样瓶中并加盖。采用日立L-8900氨基酸分析仪测定全鱼和饲料样品的氨基酸含量。色氨酸依据NY/T 57—1987 以碱水解法前处理，称取40 mg 脱脂鱼粉置于20 mL 具塞玻璃试管中，加入10%氢氧化钾1 mL，混匀浸润样品，于恒温干燥箱中40 ℃水解17 h，冷却至室温后加入0.2 mL 5%对二甲氨基苯甲醛和0.2 mL 1%硝酸钠。摇匀后放入冰水中冷却，加入5 mL浓盐酸，震荡后置于恒温干燥箱中40 ℃显色45 min。取出试管冷却至室温，然后定容至20 mL，4 000 r/min离心10 min，取上清液，在590 nm波长处测定吸光值。氨基酸沉积率计算公式为：

1.6 T3、T4含量测定

T3、T4含量测定采用南京建成生物工程研究所提供的酶联免疫检测试剂盒（H222、H223）测定，测定方法按照说明书方法提供的干粉法操作。准备96孔酶标板，在酶标孔中加入样品与标准品50 μL，每孔加入生物素抗原工作液50 μL，37 ℃反应30 min后弃去孔内液体，加入洗涤液静置30 s后弃去，重复洗涤5 次。拍干后每孔加入50 μL 亲和素-HRP，37 ℃反应30 min 后弃去液体，洗板5 次。拍干后加入显色液A、B各50 μL，37 ℃避光显色10 min后，加入显色反应终止液50 μL。在450 nm波长处测定吸光值。

1.7 统计分析

数据以平均值±标准差表示。用软件SPSS 20.0 进行单因素方差分析和Duncan’s 多重比较，显著性水平P值为0.05。饲料氨基酸含量和鱼体氨基酸含量的相关性分析采用Pearson Correlation（2-tailed）进行分析。回归曲线利用Excel 2010制作分析。

2 结果与分析

2.1 饲料蛋白质水平对大鳞鲃摄食和生长的影响

从表3 可见，饲料蛋白质水平33.22%处理组的体增重量和干物质含量显著高于30.24%处理组（P＜0.05），随着饲料蛋白水平的增加，两者均呈先上升后下降趋势，但无显著性差异（P＞0.05）。当饲料蛋白水平达到42.15%时，鱼体增重量和干物质含量达到最大值。

表3 饲料蛋白质水平对大鳞鲃摄食和生长的影响Tab.3 Effects of dietary protein levels on feeding and growth of Barbus capito

2.2 饲料蛋白质水平对大鳞鲃氨基酸组成的影响

从表4 可见，当饲料蛋白质水平达到33.22%时，除色氨酸与苏氨酸外的蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸等8种必需氨基酸含量、鱼体氨基酸总量及必需氨基酸总量均显著高于30.24%组（P＜0.05），其他处理组之间无显著性差异（P＞0.05）。鱼体的色氨酸含量随着饲料蛋白含量增加呈显著升高趋势（P＜0.05）。在蛋氨酸、赖氨酸等10种必需氨基酸中，其中亮氨酸和赖氨酸在鱼体氨基酸组成中的占比较高。不同蛋白水平饲料氨基酸和鱼体氨基酸的相关性关系表现为极显著的正相关（P＜0.01），相关系数介于0.994～0.995（表5）。

表4 饲料蛋白质水平对大鳞鲃鱼体氨基酸组成的影响Tab.4 Effects of dietary protein levels on amino acids composition in the whole body of Barbus capito %

表5 不同蛋白质水平处理组的饲料氨基酸与鱼体氨基酸的相关分析Tab.5 Correlation analysis between diets amino acids and the whole body aminoacids of Barbus capito fed on the experimental %

2.3 饲料蛋白质水平对大鳞鲃氨基酸沉积率的影响

表6表明，随着饲料中蛋白质水平的增加，大鳞鲃全鱼的蛋氨酸等10种必需氨基酸的氨基酸沉积率均呈先上升后下降的趋势（P＜0.05），蛋白质水平至33.22%时，全鱼的必需氨基酸沉积率达到最高值，随着蛋白水平的增加，全鱼的必需氨基酸呈显著下降趋势（P＜0.05）。全鱼的氨基酸组成中甘氨酸的沉积率最高，必需氨基酸中蛋氨酸的沉积率最高，其次是赖氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸。氨基酸总量沉积率也在蛋白水平33.22%时达到最大，之后随蛋白质的增加而显著下降（P＞0.05）。

表6 饲料蛋白质水平对大鳞鲃氨基酸沉积率的影响Tab.6 Effects of dietary protein levels on amino acids retention in the whole body of Barbus capito %

以立方曲线拟合饲料蛋白质水平（x）与总必需氨基酸沉积率（y）的关系，得到回归方程：y=0.012 7x3-1.534x2+59.931x-714.68（R2=0.902 5）（图1）。根据计算得出必需氨基酸沉积率在最大值时对应的值为48.95%，对应的饲料蛋白质水平为33.33%；必需氨基酸沉积率达最小值对应的值为32.01%，对应的饲料蛋白质水平为47.20%。

图1 饲料蛋白质水平和必需氨基酸沉积率的回归分析Fig.1 Regression analysis between dietary protein levels and essential amino acid deposition rate of Barbus capito

2.4 饲料蛋白质水平对大鳞鲃血清中T3和T4含量的影响

从表7 可见，大鳞鲃血清T4 水平较T3 水平高，T3 的含量随饲料中蛋白质水平的增加呈先升高后下降的趋势（P＜0.05），蛋白质水平达到45.33%时，血清中T3、T4 的含量均达到最大值。蛋白水平达42.15%时，血清中T4的含量显著上升（P＜0.05）。

表7 饲料蛋白质水平对大鳞鲃血清中T3和T4含量的影响Tab.7 Effects of dietary protein levels on the contents of T3 and T4 in serum of Barbus capito

3 讨论

3.1 饲料蛋白水平与大鳞鲃鱼体氨基酸组成及鱼体氨基酸沉积率的影响

试验结果表明，当饲料蛋白质水平达到33.22%时，除色氨酸与苏氨酸以外的八种必需氨基酸含量、鱼体氨基酸总量及必需氨基酸总量均显著高于30.24%组（P＜0.05），其他处理组之间无显著性差异（P＞0.05）。Jiang 等[17]对杂交石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatu♂s）的研究表明，饲料蛋白质水平与肌肉氨基酸组成无显著性影响。Schwarz 等[18]研究发现，鲤（Cyprinus carpio）的肌肉氨基酸组成也未受饲料蛋白水平的影响。这与本试验的结果相似，Ye 等[19]对两种不同体重的异育银鲫（Carassius auratus gibelio）幼鱼研究发现，初始重量3.18 g处理组的肌肉氨基酸组成在不同饲料蛋白水平下无差异，但初始重量87.1 g处理组的肌肉氨基酸组成中的必需氨基酸总量和非必需氨基酸总量均随着饲料蛋白水平的升高而增加。但本试验研究发现，饲料蛋白水平33.22%组的氨基酸含量显著高于饲料蛋白水平30.24%组，当饲料蛋白水平高于33.22%时，鱼体的氨基酸并没有随着饲料的氨基酸含量增加而呈现显著升高趋势。分析认为，当饲料蛋白水平低于33.22%时，饲料中的氨基酸含量不满足大鳞鲃的最低生长需求，表现为鱼体的各种氨基酸含量均较低。

氨基酸是鱼体合成蛋白质的基础，饲料氨基酸的利用效率越高也说明饲料的品质越好，饲料中的氨基酸组成成分也更接近于氨基酸平衡。对斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）和不同食性鲤研究表明鱼体机体组织的必需氨基酸组成和饲料中的氨基酸的提供存在明显的相关关系[20-21]。本试验结果发现，不同蛋白水平饲料氨基酸和鱼体氨基酸之间的相关性系数介于0.994～0.995，均为极显著的正相关关系，表明以酪蛋白、鱼粉和小麦水解蛋白组成的蛋白混合物为蛋白源能够满足大鳞鲃对于氨基酸的需求。在不同蛋白水平处理组中，10种必需氨基酸中蛋氨酸的沉积率均为最高，其次是赖氨酸。可推测出蛋氨酸是大鳞鲃的第一限制性氨基酸[18]，这也说明蛋氨酸在大鳞鲃幼鱼生长发育中需求量较大。因此在后续的研究中，可考虑饲料中适量添加蛋氨酸以促进大鳞鲃生长。试验结果表明，饲料蛋白水平达到33.22%时，鱼体的各种氨基酸及氨基酸总量沉积率达到最高值。经饲料蛋白质水平（x）与总必需氨基酸沉积率（y）回归分析得出，在饲料蛋白水平达到33.33%时，鱼体的总必需氨基酸沉积率达到最高值，鱼体对饲料中的必需氨基酸利用最为高效。结合鱼体增重量和鱼体氨基酸含量可知，33.33%的饲料蛋白水平为满足大鳞鲃生长的最低蛋白水平。以氨基酸沉积率为评定指标，饲料蛋白水平在33.33%～47.20%时，鱼体能够对饲料中的氨基酸有效利用，过高的蛋白水平则会造成蛋白资源的浪费。

3.2 饲料蛋白水平与大鳞鲃血清T3、T4水平的影响

饲料蛋白质通过调控甲状腺轴来影响机体生长。T3 能够促进氨基酸吸收，提高鱼体蛋白质合成与沉积，从而促进鱼类生长发育[22-23]。在低等脊椎动物中，甲状腺激素的主要作用是促进生长和发育[24]。有报道表明，甲状腺主要分泌T4 进入血液到肝脏，通过肝脏5’D 单脱碘酶脱碘转化为T3。甲状腺激素中T3 较容易进入细胞，并与核受体结合，且T3 的活性较T4 更高，更新更快[12]。故T3 更能代表甲状腺的功能，是体内发挥效能的主要甲状腺激素[25]。饲料蛋白摄入量也会影响鱼类甲状腺激素的分泌[26]。试验结果表明，饲料蛋白水平在30.24%～45.33%范围内，大鳞鲃血清中的T3 水平随蛋白水平的升高而呈上升趋势（P＜0.05）。虹鳟（Oncorhynchus mykiss）在长期禁食的情况下，虹鳟血清中的T3 和T4、肝核受体数量减少，但恢复饮食后，虹鳟血清中的T3 和T4 含量随饲料摄入蛋白质量的增加而增加[27]。对黑鲷（Acanthopagrus schlegelii）的研究报道称，在饥饿15 d、30d 状态下血清中T3 水平均显著低于对照组（P＜0.05）[28]。这些试验结果表明，饲料的蛋白质水平可调节鱼体的甲状腺激素分泌，对鱼类血清T3、T4 含量存在显著影响。

王桂芹等[29]对翘嘴红鲌（Erythroculter ilishaeformis）幼鱼的研究表明，血清T3 水平与饲料蛋白水平正相关，但对血清中T4的含量无显著影响。试验中血清T4含量在饲料蛋白水平在30.24%～39.33%范围内无显著影响，但血清中T3的含量随着蛋白水平升高而上升，这说明饲料蛋白水平的升高提高了5’D单脱碘酶的活性，从而促进了T4 向T3 的转化，增强了核内依赖于DNA 的RNA 聚合酶的活性，促进特异RNA的合成，进而促进蛋白质和相关酶的合成，从而促进鱼体的生长与发育。饲料蛋白水平达到42.15%时，大鳞鲃血清中的T4含量显著提高（P＜0.05）。这与当饲料蛋白水平达到42.15%时，鱼体的增重量最高的结果一致。可推测出当饲料蛋白水平变化较大时，可促进甲状腺分泌。本试验结果表明，血清中T3、T4水平与鱼体的增重量呈正相关。这说明在一定的蛋白水平范围内，蛋白质摄入可以增加甲状腺激素的分泌，促进大鳞鲃的生长。