台州地区1 376例育龄女性MTHFR基因多态性分析

许美芬，梁玲芝，徐友文

(台州市中心医院(台州学院附属医院)医学检验科，浙江 台州 318000)

中国是出生缺陷高发国家，WHO估计我国出生缺陷发生率为5.6%，每年新增出生缺陷数约为90万例。有研究表明，育龄女性体内叶酸缺乏是引起胎儿出生缺陷的主要因素，而叶酸摄入不足和由遗传因素引起的叶酸利用率障碍是体内叶酸缺乏的主要原因。MTHFR是叶酸的代谢关键酶，最常见的两种突变位点为C677T 和A1298C。相关文献报道指出，基因多态性与妊娠期高血压疾病、神经管缺陷和新生儿自闭症等疾病有关，而基因多态性存在种族及地域的差异性。本研究调查台州地区育龄女性基因C677T和A1298C位点基因型分布，并与国内其他地区进行比较，进而阐明本地区女性基因的遗传特征，以期能帮助临床医生针对性制定个体化叶酸补充方案，从而有效预防和降低出生缺陷的发生。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2016年4月—2019年4月在台州市中心医院(台州学院附属医院)进行孕前或孕期检查的女性1 376名，平均年龄(29.39±4.84)岁。本研究经台州市中心医院(台州学院附属医院)伦理委员会批准，且研究对象签署知情同意书。

1.2 检测 采集研究对象静脉血2 mL，EDTA-K2抗凝。按照血液基因组DNA提取试剂盒(苏州天隆生物技术有限公司)的说明书提取研究对象的基因组DNA，采用荧光定量PCR法检测C677T和A1298C基因多态性。PCR 扩增程序为 95 ℃总变性 10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火40 s，40个循环后 60 ℃采集荧光。根据叶酸代谢能力测定试剂盒(江西诺德医疗器械有限公司)说明书及荧光采集量判断基因型。

1.3 统计学分析 应用HaploView 4.2软件进行SNPs的Hardy-Weinberg 平衡，LD水平和单倍型结构分析。采用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计学分析，计数资料采用率(%)表示，对基因型及等位基因频率进行检验，<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg 遗传平衡分析结果基因C677T位点基因型有野生型CC、杂合型CT和突变型TT；基因A1298C位点基因型有野生型AA、杂合型AC和突变型CC。本研究对象基因C677T和A1298C两个位点的基因多态性分布均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡(>0.05)，表明本研究对象具有该区域的群体代表性。

2.2 基因型分布特征 本研究中1 376名女性的基因C677T位点以杂合型CT为主，A1298C位点以野生型AA为主。将两位点的基因型分布特征与相关文献报道的数据进行比较，结果显示：台州地区女性基因C677T位点的基因型分布特征与琼海、南宁、武汉、乌鲁木齐、辽源、烟台、廊坊和新乡比较，基因A1298C位点的基因型分布特征与琼海、南宁、长沙、辽源、烟台、廊坊和新乡比较，差异均有统计学意义(<0.05)。见表1。

表1 不同地区女性MTHFR 基因C677T和A1298C位点基因型分布特征[n(%)]

2.3 等位基因分布特征 将本研究中基因C677T和A1298C位点的等位基因分布特征与相关文献报道的数据进行比较，结果显示：台州地区女性基因C677T位点等位基因C、T和A1298C位点等位基因A、C分布情况与湘潭、昆明比较，差异无统计学意义(>0.05)；与琼海、南宁、辽源、烟台、廊坊和新乡比较，差异具有统计学意义(<0.05)。见表2。

表2 不同地区女性MTHFR 基因C677T和A1298C位点等位基因分布特征[n(%)]

2.4C677T 和 A1298C位点连锁情况及单倍型分析结果 本研究中最常见的组合是CT/AA(31.5%，433/1 376)，其次是CC/AC(19.0%，261/1 376)、CC/AA(17.9%，246/1 376)、TT/AA(14.4%，199/1 376)、CT/AC(12.4%，171/1 376)，CC/CC(4.8%，66/1 376)，未检测到TT/AC、TT/CC和CT/CC这3种组合。HaploView 4.2 软件分析结果显示：台州地区女性C677T和A1298C两位点构建的单倍型有3种组合，即677C/1298A(43.1%)、677T/1298A(36.4%)、677C/1298C(20.5%)，两位点间存在完全连锁不平衡现象(D’=1.0)。

2.5基因C677T和A1298C两位点基因型代谢型分布 台州地区1 376名育龄女性基因代谢型以较弱代谢型为主，正常代谢型为36.85%。见表3。

表3 台州地区1 376名育龄女性MTHFR 基因C677T和A1298C两位点基因型代谢型分布

3 讨论

的主要生理功能是催化5，10-亚甲基四氢叶酸(5，10-MTHF)转化为5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)，后者是体内重要的甲基供体，在同型半胱氨酸复甲基化生成蛋氨酸的过程中参与同型半胱氨酸的代谢。基因最常见的两种突变位点为C677T 和A1298C，C677T 突变是一种常见的不耐热错义突变，该位点发生突变将导致酶的热稳定性下降，以致酶活性降低。与野生型相比，纯合突变和杂合突变后酶活性分别为原来的32%和64%。A1298C这一突变位点位于酶的S-腺苷蛋氨酸调节域，其与的结合可通过构象的转变抑制酶的活性，同样使酶活性下降。有研究表明，当以上两个位点同时发生杂合突变时，即677CT/1298AC 基因型，其的酶活性仅为野生型的36%，这将造成叶酸代谢障碍，大大增加了新生儿神经管缺陷、唐氏综合征及唇腭裂等疾病的发病风险，对于这类人群则需要补充更大剂量的叶酸才能达到预期的效果。

目前，尚未有台州地区大样本育龄女性叶酸代谢基因的报道，本研究对台州地区育龄女性基因C677T和A1298C位点基因型分布进行调查分析，结果显示：C677T位点的CC、CT和TT基因型频率分别为41.6%、43.9%和14.5%，A1298C基因位点的AA、AC和CC基因型频率分别为63.8%、31.4%和4.8%，C677T位点的等位基因C、T的频率分别为63.6%、36.4%，A1298C位点的等位基因A、C的频率分别为79.5%、20.5%。进一步与其他已报道地区的数据进行比较，结果显示：C677T和A1298C位点的基因型频率和等位基因频率与已报道的辽源、廊坊、烟台、南宁、琼海和新乡等地差异显著。分析发现，本研究中C677T位点的TT型频率为14.5%，符合南方城市(琼海6.2%、南宁7.7%、湘潭12.6%)TT型频率低于北方城市(乌鲁木齐24.1%、烟台32.2%、廊坊33.9%)的分布特点，这也与我国神经管出生缺陷发病率呈现“南低北高”的现象相符，究其原因可能与研究对象的种族、地区和遗传背景等不同密切相关。

本研究结果还显示，台州地区育龄女性C677T和A1298C两位点最常见的组合是 CT/AA(31.5%)，未检测到TT/AC、TT/CC和CT/CC这3种组合；C677T 和 A1298C两位点存在单倍型连锁不平衡，这与陈徐等的报道相一致。本研究中，育龄女性的基因代谢型正常代谢型才占36.85%，这意味着超过60%的育龄女性存在叶酸代谢障碍的风险，对存在突变基因型而引起叶酸代谢能力障碍的女性而言，补充0.4 mg常规剂量的叶酸并不能达到预期的效果，需要更多的叶酸量才能减少孕期疾病的发生，降低新生儿缺陷的发生率。

综上所述，台州地区育龄女性C677T和A1298C两位点的基因型及等位基因分布具有区域特异性。因此，通过开展叶酸代谢关键酶基因多态性的大样本分子流行病学调查，筛选出叶酸代谢障碍的育龄女性，根据其基因型为育龄妇女制定个体化的叶酸补充方案，为指导本地区育龄女性合理选择叶酸剂量提供一定的科学理论依据。