血管紧张素转化酶抑制肽Leu-Lys-Pro(LKP)抑制机理的研究

徐晓晴，周 倩，孙建华，孙丽霞，冯学珍, 2，徐永芳，童张法，廖丹葵*

1. 广西石油资源加工及过程加强化技术重点实验室，广西大学化学化工学院，广西 南宁 530000 2. 广西科技大学医学部，广西 柳州 545006

引 言

高血压作为最常见的慢性病，对人类健康产生严重威胁，已成为全球重要的公共卫生问题[1]。 血管紧张素转化酶活性过高会使血压升高，通过抑制血管紧张素转化酶(angiotensin-Ⅰ converting enzyme，ACE)的活性降低血压已证明是治疗高血压的有效方法之一，ACE抑制剂类药物如卡托普利等具有较好的降压效果，但会引起咳嗽、 皮疹等副作用[2]。 近年来，从食源性蛋白中分离出多种ACE抑制肽，与化学合成的降血压药物相比，具有副作用小、 吸收好等优点[3]，可在一定范围内有效改善调节血压。

以往研究多集中在ACE抑制肽的提取与鉴定，关于ACE与抑制肽在分子水平上相互作用的研究还处于起步阶段，而两者的作用机制研究是研发新药的基础。 Yan等[4]通过3D-QSRA、 分子对接和分子动力学研究了C-末端为色氨酸的ACE抑制肽VKW与GTW和ACE相互作用，结果表明ACE-VKW复合物比ACE-GTW复合物更稳定，因此VKW与ACE具有更高的亲和力和活性。 Lan等[5]利用光谱法、 等温滴定量热及分子对接模拟研究了GF-6与ACE的相互作用机制，发现GF-6主要通过氢键作用结合在ACE非活性部位。 迄今为止，仍有大量ACE抑制肽与ACE的作用机制缺乏研究。

荧光光谱、 紫外-可见吸收光谱可以分析蛋白质大分子与小分子作用类型，分析蛋白质构象的改变，是研究分子间相互作用的重要方法[6]。 圆二色谱可以表征蛋白质分子与小分子结合前后二级结构的改变。 等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry，ITC)可根据焓变与熵变的不同推测结合驱动力等信息，更加深入了解大分子与小分子结合的作用机制。 分子对接可以有效分析蛋白质大分子与小分子的相互作用[7]。 本工作采用多光谱法、 等温滴定量热以及分子对接研究分析ACE与LKP相互作用机理，为ACE抑制肽的应用提供基础数据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

试剂： 猪肺ACE由本实验室自提(1.23 U·mg-1)，用pH 7.0 HEPES缓冲溶液(含0.3 mol·L-1NaCl)配制成2.0×10-6mol·L-1的储备液，LKP(纯度>98%，经实验验证IC500.32 μmol·L-1由上海拜尔迪公司合成)，用上述缓冲液配制成0.01 mol·L-1的储备液。 HEPES(上海麦克林公司)，NaCl(四川成都科隆有限公司)。

仪器： Nano等温滴定量热仪(美国TA公司)； UV-2501PC紫外可见分光光度计(日本岛津公司)； MOS-450圆二色谱仪(法国Biologi公司); SF QY-9000荧光分光光度计(北京卓立汉光仪器公司)。

1.2 方法

1.2.1 荧光及紫外光谱分析

ACE的浓度为1.0×10-6mol·L-1，加入不同浓度的LKP，以相应浓度的LKP溶液为参比，设置激发波长为280 nm，激发与发射狭缝均为5 nm，在不同温度(288，293和298 K)下，扫描反应体系300～500 nm的发射光谱，研究LKP对ACE的猝灭机制。

以相应浓度的LKP溶液为参比，扫描200～350 nm的紫外吸收光谱，研究在不同温度(288，293和298 K)下，ACE-LKP体系光谱变化规律。

1.2.2 圆二色谱

ACE的浓度为1.0×10-6mol·L-1，用HEPES缓冲液进行背景测试，用0.1 cm比色皿测定190～260 nm的CD谱。 研究LKP对ACE二级结构的影响。

1.2.3 等温滴定量热

将250 μL ACE(0.4×10-6mol·L-1)溶液注入样品池，LKP(2.8×10-3mol·L-1)装入注射器，待温度(288，293和298 K)稳定后，开始向样品池中连续滴加20滴LKP溶液，每滴2.5 μL，研究ACE与LKP的相互作用。

1.2.4 分子对接

使用软件Auto Dock Vina进行分子对接模拟。 LKP的结构使用Chemdraw生成并优化。 ACE的晶体结构在 Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb)下载。 对接运行后获得具有最低结合能的构象。 对接结果及相互作用力分析使用PyMOL(De Lano Scientific LLC, USA)软件，研究LKP与ACE结合机制。

2 结果与讨论

2.1 LKP对ACE的荧光猝灭机制研究

ACE的荧光主要是由色氨酸、 酪氨酸以及苯丙氨酸残基发出，在不同温度下，不同浓度LKP与ACE作用的荧光光谱如图1(a—c)所示。

图1 不同温度下ACE与LKP结合的荧光发射光谱(a)—(c): 288，293，298 K，c(ACE)= 1.0×10-6 mol·L-1Fig.1 Fluorescence emission spectra of ACEwith LKP at different temperatures(a)—(c): 288，293，298 K，c(ACE)= 1.0×10-6 mol·L-1

由图1结果可知，随着LKP浓度的增加，ACE的荧光强度不断降低，表明LKP能引起ACE的荧光猝灭，荧光猝灭过程分为静态猝灭与动态猝灭[8]。 做不同温度下F0/F对[Q]的Stern-Volmer曲线[9](F0： 未加猝灭剂；F： 加猝灭剂荧光强度)，结果如图2。

由表1可知，随温度升高猝灭常数Ksv减小，且Kq均远大于2.0×1010L·s-1·mol-1(Kq： 猝灭过程速率常数)由此判断LKP对ACE的猝灭机制为静态猝灭。 此外，随LKP浓度的增加，ACE最大发射峰位置先红移后蓝移，说明ACE荧光生色基团所处的微环境发生改变。 为进一步研究LKP对ACE蛋白空间构象的影响，采用紫外-可见吸收光谱和圆二色谱进行分析。

图2 ACE与LKP结合的Stern-Volmer图Fig.2 The Stern-Volmer plots of ACE with LKP

表1 不同温度下ACE与LKP结合的猝灭常数Table 1 Quenching constants of ACE withLKP at different temperatures

2.2 LKP对ACE结构的影响

2.2.1 紫外可见吸收光谱

不同温度下，ACE与LKP结合的紫外可见吸收光谱如图3(a—c)所示。

由图3可知，ACE的吸收光谱具有两个吸收峰，221 nm处的强吸收峰为肽主链的特征峰，280 nm处的弱吸收峰为芳香族氨基酸的特征峰[10]。 随着LKP浓度的升高，ACE的吸收光谱发生减色效应，221 nm吸收峰红移，温度越高移动越明显，分析认为LKP的π*空轨道与ACE分子上氨基酸残基的π电子轨道之间发生偶合，导致能级下降[11]，以及芳香族氨基酸残基所处的微环境发生改变[12]。 由此说明ACE与LKP结合生成复合物，使ACE的构象改变。

2.2.2 圆二色谱

不同的二级结构产生的圆二色谱CD谱带的位置以及吸收强弱都是不同的[13]。 为进一步了解LKP对ACE蛋白构象的影响，测量LKP与ACE结合的CD光谱，结果如图4所示。

采用CDpro软件对CD数据进行分析，ACE的二级结构含量由大到小依次是： 无规则卷曲，β-折叠，β-转角，α-螺旋。 其中α-螺旋含量由10.8%降至0.1%后上升至10.2%； β-折叠由22.9%升至38.8%后降到34.8%； β-转角由13.8%降至9.5%后升到11%； 无规则卷曲由49.4%升至50.8%后降至41.5%。 说明当LKP含量较少时，ACE的二级结构是由α-螺旋逐渐向β-折叠与无规则卷曲结构转变，说明ACE肽链结构逐渐舒展，结构变得松散； LKP逐渐增加后，肽链结构又进行了折叠收缩，结构变得紧密，最终ACE的空间结构比未加入LKP时松散，表明LKP能够使ACE的二级结构发生显著变化，原因可能为LKP与ACE结合使蛋白质原有的氢键网络结构发生改变，引起肽链的重排，从而导致空间构象的改变。

图3 不同温度下ACE与LKP结合的紫外吸收光谱(a)—(c): 288，293，298 K，c(ACE)=1.0×10-6 mol·L-1，c(LKP)(0—4): 0，0.28，1.4，2.8，4.2×10-3 mol·L-1Fig.3 UV absorption spectra of ACE withLKP at different temperatures(a)—(c): 288，293，298 K，c(ACE)=1.0×10-6 mol·L-1，c(LKP)(0—4): 0，0.28，1.4，2.8，4.2×10-3 mol·L-1

2.3 LKP与ACE的热力学参数及作用力类型

LKP与ACE作用的等温滴定量热曲线图如图5(a—c)，采用NanoAnalyze软件分析得到的热力学参数列于表2。

由公式ΔG=ΔH-TΔS可知，吉布斯自由能的变化ΔG包括两个部分，即焓变项(ΔH)和熵变项(-TΔS)。 由表2结果可知，ΔG<0证明反应具有自发性，ΔH>0说明LKP与ACE的结合过程是吸热的。 ΔS值大说明有较大的疏水作用，因此结合力主要表现为疏水作用力。 三个温度下，|-TΔS|>|ΔH|，说明LKP与ACE的结合主要以熵驱动为主，ΔCp为较大的负值，说明LKP与ACE结合属于非刚性结合，结合过程中ACE表面的疏水基团被亲水基团包埋，蛋白质产生的空间构象变化使得表面的结合位点不能再和抑制肽结合。 288 K时，LKP与ACE的结合位点数为0.131，与另外两个温度的结果差异较大是因为温度较低导致ACE失活严重，因此与LKP的结合位点数较小。 随着温度的升高，结合位点数逐渐增大，温度升高会使ACE的空间构象发生变化，ACE的肽链伸展，使氨基酸残基暴露出来，更有利于与LKP的结合。

图4 ACE与LKP结合的圆二色谱图298 K, c(ACE)= 1.0×10-6 mol·L-1Fig.4 CD spectra of ACE with LKP298 K, c(ACE)= 1.0×10-6 mol·L-1

图5 不同温度下LKP滴定ACE的热流曲线图(a)—(c): 288，293，298 K，c(ACE)=0.4 μmol·L-1，c(LKP)=2.8 mmol·L-1Fig.5 The heat flow of binding LKP to ACE(a)—(c): 288，293，298 K，c(ACE)=0.4 μmol·L-1，c(LKP)=2.8 mmol·L-1

表2 LKP与ACE结合的热力学参数Table 2 Thermodynamics parameter of binding of LKP and ACE

实验结果表明，LKP与ACE的结合位点数约为1，与ACE的抑制剂卡托普利、 依那普利等的结合位点数相近，但LKP与ACE的结合常数都远小于卡托普利、 依那普利等抑制剂与ACE的结合常数[14]。 卡托普利、 依那普利等药物的分子结构中的官能团能够和锌离子结合形成稳定的多面体结构，这个作用过程对亲和力的影响非常大[15]。 说明LKP是与活性中心的结合口袋发生作用，没有和锌离子结合。 综上所述，LKP与ACE的活性中心结合作用，反应为自发进行的吸热过程，主要驱动力为熵驱动，结合作用力为疏水作用力。

2.4 分子对接

选择tACE作为蛋白质大分子，以锌离子为中心设置结合口袋中心，调整结合口袋体积，对接盒子范围为(40 Å×40 Å×40 Å)。 LKP与ACE的对接结果如图6(a,b)所示，结构能量为-7.5 kcal·m-1。

图6 LKP与ACE的分子对接(a)： LKP与ACE的对接模型；(b)： LKP与ACE分子上氨基酸残基的相互作用Fig.6 The docking simulation of LKP binding to ACE(a): The docking simulation of LKP binding to ACE;(b): The interaction between LKP and the residues of ACE is shown

3 结 论

通过多光谱法结合等温滴定量热实验、 分子对接等方法研究LKP与ACE相互作用。 荧光光谱表明LKP通过静态猝灭机制有效猝灭ACE的内源荧光。 紫外可见吸收光谱、 圆二色谱实验表明，在抑制肽LKP的作用下，ACE二级结构比未加入LKP时疏松，LKP对ACE的空间构象具有显著影响。 ITC实验结果表明，LKP与ACE为非刚性结合，是由熵驱动的自发吸热反应，主要作用力为疏水作用。 分子对接模拟表明LKP通过疏水作用与ACE在活性中心S1口袋进行结合。 本研究有助于了解ACE与其抑制肽相互作用机理，为开发新的治疗高血压药物提供基础数据。