基于细胞类型特异性网络的雷公藤治疗类风湿性关节炎作用机制解析△

任兴德，纪徐维晟，刘淑明，王耘*

1.北京中医药大学 生命科学学院，北京 102488；2.北京中医药大学 中药信息工程中心，北京 102488

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，以滑膜关节的结缔组织炎症为主要症状，当前全世界有2200 万～7600 万人患有该疾病[1]。RA 可致患者行动不便，病情严重时会致残。RA的发病机制十分复杂，目前仍未明确，一般认为是由感染和炎症因子引发。当前针对RA 的治疗暂无特效药，临床上主要使用的化学药有非甾体抗炎药、糖皮质激素、生物制剂等，但这些药物长期使用通常有较为严重的不良反应[2]。中医认为RA 属于痹症范畴，邪气痹阻经脉为其病机，临床上治疗以祛风除湿、活血通络为主[3]。相比于化学药治疗，中药治疗具有疗效显著且不良反应少的优势[4]。雷公藤是中医治疗RA 的常用药，研究表明雷公藤对于RA 有良好的治疗效果[5]，但是其作用机制尚不明确，这限制了雷公藤在医学实践中的应用。

由于中药多成分、多靶点的特性，导致其作用机制难以明确，严重制约了中医药的发展。为了解决该问题，目前学界进行了大量的研究，包括中药药理学、中药化学、分子生物学、网络药理学等[6]。由于传统的实验研究周期长、人力物力消耗大，因此近年来网络药理学备受关注[7]。网络药理学基于疾病-基因-靶点-药物相互作用网络，从多途径、多靶点角度系统研究中药的作用机制[8]。这种研究方法的整体性、系统性特点与中医药治疗的特点相契合，为科研人员提供了一种利用生物信息学数据研究中药的手段。但是，当前网络药理学解析中药作用机制时比较依赖于富集分析，富集分析是一种寻找目标基因集合的共同功能或通路的生物信息学方法[9]。利用该方法可以获得中药所作用的通路数据，但是其详细作用机制却难以被阐明；且富集分析所使用的背景数据是一种通用型数据，难以描述中药在特定类型细胞中的作用机制。另外，网络药理学多是通过中药-化学成分-药物与疾病交集靶点及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）关系而构建的网络，对于除PPI网络以外的生物网络利用较少，这在一定程度上限制了其发展。

细胞类型特异性网络是一种以某类细胞特异性表达的蛋白质和产生的分子所参与的反应为基础而构建的生化反应网络，能够将细胞内的基因、蛋白质、小分子、复合物和信号分子数据进行有效整合，更加准确地模拟细胞的生物学功能[10]，其侧重点与网络药理学有所不同。细胞类型特异性网络是网络药理学的进一步发展，其更关注的是特定细胞内的真实生物网络。目前已经有不少基于该理论开展的研究，如重建肝细胞代谢网络用以研究肝细胞的肝酶缺陷症[11]、使用肾脏代谢模型预测药物的脱靶效应[12]等。尽管细胞类型特异性网络已经有了初步的发展，但是基于该理论进行中药的作用机制解析研究相对较少。因此，本研究通过细胞类型特异性网络研究雷公藤治疗RA 的作用机制，以期更系统、全面地解析雷公藤的作用机制。

1 数据来源与方法

1.1 雷公藤化学成分及靶点筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）收集雷公藤的化学成分[13]。以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 对所获得的化学成分进行筛选，将筛选结果作为雷公藤的有效成分。通过Similarity Ensemble Approach 数据库（SEA，https://sea.bkslab.org/）[14]检索雷公藤有效成分的靶点，将所得结果以MaxTC＞0.7（MaxTC代表化学结构相似性系数，越接近于1，所得结果的可靠性越高）为条件进行筛选。

1.2 RA疾病相关靶点筛选

以“rheumatoid arthritis”为关键词，通过TTD数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）检索RA 相关靶点[15]，为了保证靶点数据的有效性，只保留了标注为“Successful”的疾病相关靶点。

1.3 生化反应数据

Reactome 数据库（https://reactome.org）是一个同行审阅、人工策展的关于人体内各项反应及生物学通路的数据库，包含转录调控数据、PPI数据、信号通路数据、小分子代谢数据[16]。从该数据库下载所有的生物学通路数据用于背景网络的构建，数据覆盖人类12 929个蛋白质、13 210个复合物、13 534 个生化反应、2477个通路。

1.4 不同细胞类型的基因表达数据

Fantom 数据库（https://fantom.gsc.riken.jp/5）提供了人体不同类型原代细胞的基因表达谱数据。从该数据库中提取B 淋巴细胞的特异性基因表达数据用于背景网络的剪切。

1.5 细胞类型特异性网络构建

B 淋巴细胞是一类重要的免疫细胞，与RA 的发病关系密切[17]，因此本研究基于该细胞的基因表达数据构建B 淋巴细胞的细胞类型特异性网络。蛋白质是细胞行使生物学功能的主要物质，整合某一类细胞内的蛋白质所参与的生化反应即可得到该类细胞的细胞类型特异性网络[18]。首先利用生物学数据构建背景网络，然后根据一类细胞的蛋白质表达数据，剪切掉与表达量为0 的蛋白质相关的反应。若某种蛋白质的表达量为0，则将其参与的反应节点及自身节点从反应网络中剪切掉；若该蛋白质是反应的生成物，则相应的反应节点和自身节点也需要剪切掉。按照上述规则即可得到相应细胞的细胞类型特异性网络。

1.6 基于实体语法系统（EGS）推理雷公藤治疗RA的作用机制

EGS[19]是为生物复杂系统建模而提出的一种形式语法系统，源于Chomsky 生成语法系统，是对Chomsky 生成语法系统的进一步拓展。EGS 由5 元组G=（VN，VT，F，P，S）组成。VN表示非末端字符集；VT表示末端字符集，VN∩VT=Φ；F 表示EGS中元素之间的基本关系集；P 表示推理规则集，是EGS 用于演绎的基本规则；S 是利用EGS 进行推导和证明时的初始状态集。EGS 在中医药研究中已经得到了广泛的应用[20-21]。

本研究利用EGS 构建B 淋巴细胞的细胞类型特异性网络形式化模型，进行雷公藤治疗RA 的作用机制的推理。首先用EGS 融合Reactome 当中的所有人体生化反应数据，得到人体的生化反应网络；随后依据Fantom 数据库中的B 淋巴细胞基因表达数据对生化反应网络进行剪切，得到B 淋巴细胞类型特异性网络；最后以雷公藤药物靶点为起点，以RA疾病靶点为终点，绘制雷公藤药物靶点到RA 疾病靶点的网络路径图，并基于此网络分析雷公藤的作用机制。

2 结果与讨论

2.1 雷公藤化学成分及靶点

通过TCMSP 收集雷公藤的化学成分144 个。以OB≥30%和DL≥0.18对所获得的化学成分进行筛选，得到雷公藤的有效成分51个。通过SEA 数据库检索并筛选得到雷公藤有效成分与靶点得对应数据，见表1。

表1 雷公藤化学成分及靶点

2.2 RA疾病相关靶点

以“rheumatoid arthritis”为关键词，通过TTD数据库检索RA 相关靶点，得到标注为“Successful”的RA 相关靶点66 个，包括酪氨酸-蛋白激酶JAK2、肿瘤坏死因子（TNF）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）、二羟基二苯二酸脱氢酶（DHODH）、B 淋巴细胞抗原CD19、白细胞介素-6受体（IL6R）、白细胞介素-6（IL-6）、酪氨酸-蛋白激酶BTK、血管内皮生长因子A（VEGFA）、基质金属蛋白酶1（MMP1）等。

2.3 B淋巴细胞的细胞类型特异性网络

所得到的B 淋巴细胞类型特异性网络共有节点36 962 个，边66 177 条，其中包含反应10 153 个、复合物10 686个、蛋白质11 239个、小分子2733个、DNA 568个、RNA 249个、其他分子1324个（图1）。该网络只包含了与B 淋巴细胞表达蛋白相关的反应，能够更加准确地模拟B 淋巴细胞的生物学功能，将作为背景网络用于雷公藤作用机制的定性推理。

图1 B淋巴细胞的细胞类型特异性网络

2.4 雷公藤有效成分作用靶点与RA 疾病相关靶点的作用机制网络

基于B 淋巴细胞的细胞类型特异性网络，利用实体语法系统推导得到雷公藤有效成分作用于B 淋巴细胞后的生物学效应网络（图2），共有节点247个、边296 条。节点大小与节点的度值成正比，其在一定程度上反映了节点在网络中的重要性。由图2 可以看出，雷公藤通过多成分、多靶点、多途径起到了调节RA 的作用。雷公藤中常春藤素、威尔福莱德A、雷公藤红素、异黄酮醇、β-谷甾醇、白桦脂酸、山柰酚、雷公藤甲素、诺比列汀9 个有效成分通过雌激素受体β（ESR2）、雌激素受体α（ESR1）、酪氨酸蛋白磷酸酶非受体1 型（PTPN1）、核受体亚家族1 H 组成员2（NR1H2）、类泛素蛋白修饰分子（SUMO）激活酶亚基2（UBA2）、SAE1、DNA 拓扑异构酶2α（TOP2A）、雄激素受体（AR）、NR1H3、CC 趋化因子受体4 型（CCR4）、多药耐药相关蛋白1（ABCC1）、G 蛋白偶联胆汁酸受体1（GPBAR1）、核受体ROR-γ（RORC）前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、腺苷三磷酸结合盒转运体G2（ABCG2）、转录因子p65（RELA）、醛酮还原酶家族1 员B1（AKR1B1）、多不饱和脂肪酸5-脂氧合酶（ALOX5）18 个靶点，作用于T 淋巴细胞活化抗原CD80、CD86、CD19、酪氨酸蛋白激酶（SYK）、核受体亚家族3 C 组成员1（NR3C1）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARA）、酪氨酸蛋白激酶（BTK）、JAK1、β-干扰素（IFNB1）、JAK2、CCR5、C5、大麻素受体2（CNR2）、1-磷酸鞘氨醇受体1（S1PR1）、IL-6、雌激素相关受体α（ESRRA）、PTGS2、ABCG2、RELA、AKR1B1、多不饱和ALOX521个RA的疾病相关靶点，进而起到了治疗作用。其中PTGS2、ABCG2、RELA、AKR1B1、ALOX5 既是雷公藤的直接作用靶点，也是RA 的疾病相关靶点。

图2 雷公藤有效成分作用靶点与RA疾病相关靶点的作用机制

雷公藤治疗RA 的机制主要为以下几个方面：1）多个成分作用于1 个蛋白质，通过这个蛋白质影响多个RA 相关的疾病靶点。例如，白桦脂酸和威尔福莱德A 都能作用于PTPN1，PTPN1 参与下游反应后影响到了JAK1、JAK2、SYK、IFNB1 4 个疾病靶点所在的通路。PTPN1 可以介导多种蛋白激酶的去磷酸化过程[22]，起到调节信号强度的作用。JAK1、JAK2 都属于JAK 家族，属于非受体类的酪氨酸激酶，在JAK-信号转导和转录激活因子（STAT）通路中介导信号传递[23]，该通路是免疫系统中的重要通路。SYK 也是1种非受体酪氨酸激酶，是B 细胞受体（BCR）信号通路中的关键激酶，也是其他免疫受体如Fc 受体和黏附受体信号转导的关键组成部分，主要在B 淋巴细胞中表达[24]。IFNB1具有抗病毒作用，可通过JAK-STAT 通路进行免疫调节[25]。不难看出，JAK1、JAK2、SYK、IFNB1 都与胞外信号传递有关，参与了免疫细胞的功能调节。2）多个成分作用于与疾病靶点同属于同一家族的蛋白质。例如，常春藤素、β-谷甾醇、雷公藤红素、异黄酮醇等多个成分作用于RORC、NR1H2、NR1H3、ESR1、ESR2、AR 6 个蛋白质，这6 个蛋白质与疾病靶点NR3C1、ESRRA、PPARA 同属于核受体家族。核受体是配体激活的转录因子，在细胞的分化/发育、增殖和代谢过程中发挥不同作用，且与多种病症有关，如癌症、心血管疾病、炎症及生殖异常[26]。目前已有多款药物通过靶向该家族中的NR3C1、ESRRA、PPARA 治疗RA[27]。3）通过影响SUMO 结合酶UBE2I 的生成调节转录因子活性。雷公藤红素、异黄酮醇、常春藤素、β-谷甾醇通过作用于ESR1、NR1H2、NR1H3、AR 靶蛋白调节SUMO 结合酶UBE2I 的生成，进而影响PPARA、NR3C1 等疾病相关靶点蛋白的SUMO 化修饰。蛋白质的SUMO 化修饰类似于蛋白质的泛素化修饰，可以改变底物蛋白的诸多特征，如细胞内亚定位、酶活性、蛋白质结构和稳定性、转录活性[28]。UBE2I在SUMO 化修饰过程中起到至关重要的作用，除了能提供活化形式的SUMO 蛋白，还可直接将SUMO接合到特异性底物的赖氨酸残基上。雷公藤通过影响UBE2I的循环途径起到了调节转录因子PPARG 和NR3C1 活性的作用。4）调节第二信使PIP3 的生成，影响B 细胞的活化。异黄酮醇通过作用于ESR1、ESR2 调节第二信使PIP3 的生成，从而影响疾病靶点蛋白BTK、SYK 参与的信号转导过程。BTK、SYK 都是酪氨酸激酶，与B 淋巴细胞的BCR 信号转导有关，能够影响B 细胞的活化[29]。雷公藤通过调节PIP3的生成起到了调节B细胞免疫功能的作用。

2.5 作用机制网络的子图分析

对上述的作用机制网络图的进行整体分析只能获得一部分信息，要获得雷公藤有效成分影响RA疾病相关靶点的详细机制还需要对作用机制网络图进行子图分析。以1 个子图为例，对其进行分析，见图3。

如图3 所示，雷公藤的有效成分白桦脂酸通过反应1 和反应2 影响疾病靶点SYK。白桦脂酸是一种天然的五环三萜类化合物，具有抗炎、抗疟疾、抗艾滋病和抗肿瘤活性[30-32]。PTPN1是一类酪氨酸蛋白磷酸酶，在多个通路中发挥着重要的调节作用，如介导肝细胞生长因子受体（Met）的去磷酸化[33]。已有研究表明，白桦脂酸是PTPN1的抑制剂[34]。

反应1 为整合素alphallb beta3 复合物的去磷酸化反应，由PTPN1 磷酸酶催化[35]。复合物1 为反应1的产物，其为整合素alphallb beta3 复合物SRC 酪氨酸残基530 位点去磷酸化后的状态。反应2 为alphallb beta3 复合物的自磷酸化反应，该复合物聚集后激活了自身SRC 酪氨酸残基419 位点[36]，产生了复合物2。反应1 和反应2 都是整合素信号通路下的反应。

SYK 可参与各种跨膜受体下游的信号转导，包括经典免疫受体，如BCR[37]。SYK 还参与多种生物过程的调节，包括先天性和适应性免疫、细胞黏附、破骨细胞成熟、血小板活化和血管发育[38-39]，被认为是潜在的自身免疫病治疗靶点[40]。在图3 中，SYK结合于复合物2 的beta3 尾部[41]，随后由复合物3 上的SRC激活[42]，进而参与下游的各种信号转导通路。

图3 有效成分白桦脂酸影响疾病相关靶点SYK的机制子图

整体来看，PTPN1 所催化产生的产物与SYK 结合而激活了SYK 的活性，而雷公藤的有效成分白桦脂酸是PTPN1 的抑制剂，因此雷公藤的有效成分白桦脂酸通过抑制PTPN1 而阻止了SYK 与整合素alphallb beta3 复合物的结合，进而阻止了SYK 的活化，从而最终调节了RA的疾病状态。

目前，PTPN1 并未成为RA 的治疗靶点，但是有研究发现PTPN1是治疗免疫缺陷病的潜在靶点[43]。本研究解析发现，通过抑制PTPN1可以抑制SYK 的活化，这表明PTPN1或许治疗RA的潜在疾病靶点。

3 总结与展望

雷公藤治疗RA 的机制研究一直备受关注。有研究者基于计算机模拟，利用化学空间和分子对接理论探索雷公藤治疗RA 的分子作用机制[44]，发现雷公藤主要通过抗炎、调节免疫应答、抑制骨破坏来调节疾病状态；有研究者基于网络药理学探索雷公藤多苷治疗关节炎的机制[45]，发现了雷公藤多苷影响到的生物学通路主要是炎症反应和免疫调节通路；有研究者基于网络药理学探索雷公藤影响骨破坏的作用机制[46]；也有研究者整合化学物质组学和网络药理学研究雷公藤片治疗RA 的作用机制[47]，发现雷公藤主要作用于免疫系统、有机物和细胞因子等多个生物过程。综合来看，上述的研究主要基于计算机模拟和网络药理学来系统探索雷公藤治疗RA 的作用机制，发现雷公藤作用机制有一定的共同点，即雷公藤主要通过影响免疫调节和骨破坏通路来起到治疗作用。但是，以上研究未能关注到雷公藤化学成分对RA 疾病相关蛋白的间接作用机制，而药物对疾病相关蛋白的间接作用也是药物治疗疾病的重要方式之一[48]。此外，上述研究所使用的疾病相关蛋白中，有一部分在B 淋巴细胞中并未表达，如MMP13、MMP1、MMP2、Mu型阿片受体（OPRM1）、黄嘌呤脱氢酶（XDH）、电子选择素（SELE）、细胞色素P450 1A2（CYP1A2）等。因此，在使用同样的方法研究雷公藤对某一特定类型细胞的作用机制时会有所不足。与上述研究相比，本研究则较好地弥补了其不足之处。

本研究发现雷公藤主要通过影响B 淋巴细胞转录因子的活性、细胞活化及胞外信号传递起到治疗RA的作用；并以一个子图为例详细阐述了雷公藤作用靶点PTPN1和疾病相关靶点SYK 之间的联系，将细胞的基因、蛋白质、小分子、复合物和信号分子数据进行了有效整合，充分体现出了生物网络的系统性。此外，本研究推理所使用的背景网络都是基于真实实验数据所构建的，可以对中药作用的细胞内生物过程的因果关系进行细致描述，所得结果真实性、可靠性强。不过，由于目前缺乏针对单一细胞的生化反应数据库及中药的靶点信息，本研究难免会有一些局限性。相信随着未来中医药及现代科学的发展，这些问题将会被逐一解决。