不同产地和不同品种枸杞子中多糖成分测定

王莹，时锐，张南平，辜冬琳，昝珂，刘越，金红宇，马双成

1.中国食品药品检定研究院，北京 102629；2.北京中医药大学，北京 100029

枸杞作为药食两用产品，在东亚等地区已具有两千多年的使用历史[1]。枸杞作为强壮滋补药品，具有益精明目、延缓衰老、滋补肝肾等功效[2]，始载于《神农本草经》，列为上品。《中国植物志》中有记载的枸杞属植物大约有80 多种[3]，市场上广泛应用的种为宁夏枸杞Lycium barbarmL.和北方枸杞L.chinenseMill.var.potaninii（Pojark.）A.M.Lu。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版收载的枸杞子为宁夏枸杞的干燥成熟果实，这也是目前市场上的主流产品。北方枸杞为枸杞Lycium chineseMill.的变种，广泛分布于河北北部、山西北部、陕西北部等地。在枸杞商品规格的质量评价中，主要从性状特点判定其优劣，如颗粒大小、色泽等[4]，这种评判方法具有一定的局限性。《中国药典》2020 年版规定以枸杞多糖和甜菜碱作为枸杞主要质量控制指标，其中规定多糖质量分数不得少于1.8%，甜菜碱质量分数不得少于0.5%[5]。

多糖为枸杞的主要成分且是重要的功效成分，已有研究表明，枸杞多糖（LBP）具有多种生物学活性，包括抗肿瘤、免疫调节、调血脂、降血糖、视网膜保护和保肝等[6]。不同产地及不同品种枸杞中多糖成分是否存在差异，是影响枸杞质量的关键指标之一。《中国药典》2020 年版（一部）采用苯酚硫酸法测定LBP 含量，此法虽然可以从一定程度上表明多糖含量，但无法体现多糖结构特征，无法揭示不同产地及不同品种枸杞中多糖成分的差异性。鉴于此，近年来已有部分学者通过多糖结构分析，对不同产地LBP进行比较。Wu等[7]测定了50余批不同产地宁夏枸杞中多糖成分的重均相对分子质量（Mw），同时进行比较以评价枸杞质量；Liu 等[8]通过建立LBP 多元指纹图谱对不同产地枸杞质量进行评价。但目前此类研究主要集中于《中国药典》2020年版记载品种宁夏枸杞的测定，对不同品种枸杞中多糖成分的分析鲜有报道。同时有研究指出，关于LBP 的报道虽多，但大部分研究为市场购买产品，多存在样品产地及品种不确定的问题[9]。

为了深入探索不同品种及不同产地LBP 的差异性，本课题组分别从宁夏、青海、新疆、河北种植基地收集了多份枸杞样品，并经过性状和显微特征进一步确定其种，以保证来源正确。同时对其总糖含量、Mw及单糖组成进行测定，最终为枸杞质量标准完善及资源评价提供参考。

1 材料

LC-20AD 型高效液相色谱仪-示差检测器、LC-20AD 型高效液相色谱仪-光电二极管阵列检测器、UV-2700 型紫外分光光度计均购于日本岛津公司；十八角度激光光散射仪（美国Wyatt公司）。

Zorbax Eclipse XDB型C18色谱柱（250mm×4.6mm，5 μm，美国Agilent 公司）；SB-806 HQ 型凝胶色谱柱（300 mm×7.8 mm）和SB-804 HQ 型凝胶色谱柱（300 mm×7.8 mm）均购于日本Shodex 公司；对照品半乳糖（Gal，批号：100226-201807）、半乳糖醛酸（GalA，批号：111646-201702）、木糖（Xyl，批号：111508-201605）、核糖（Rib，批号：140668-202003）、葡萄糖醛酸（GlcA，批号：140648-202005）、甘露糖（Man，批号：140651-201805）、葡萄糖（Glc，批号：110833-201908）、阿拉伯糖（Ara，批号：1506-200202）、鼠李糖（Rha，批号：111683-201502）均购于中国食品药品检定研究院，纯度均大于99%；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，批号：BCBP1208V，纯度为99%，美国Acros Organics公司）；对照品右旋糖酐（批号：1721，纯度＞90%，美国聚合物标准品公司）；甲醇、乙醇、三氯甲烷、浓硫酸、氢氧化钠、三氟乙酸、盐酸、磷酸二氢钾、氢氧化钾均为分析纯，购于国药集团药业股份有限公司。

枸杞样品分别收集于宁夏、青海、新疆、河北枸杞种植基地，经中国食品药品检定研究院张南平主任药师鉴定确认其品种，共有19 批宁夏枸杞Lycium barbarmL.和3 批北方枸杞L.chinenseMill.var.potaninii（Pojark.）A.M.Lu，具体样品信息见表1。

表1 22批枸杞样品信息

2 方法与结果

2.1 枸杞粗多糖的提取

参考文献[10]实验方法粉碎样品，过三号筛，精密称定约5 g，加入80%乙醇100 mL，加热回流1 h后，趁热滤过，滤渣用80%乙醇洗涤2 次。然后将滤纸连同滤渣放置于锥形瓶中，加水80 mL，加热回流2 h，趁热滤过，滤液在水浴锅上蒸干后用5 mL水充分溶解，加入乙醇使其体积分数达到80%，4 ℃冰箱中置12 h 后取出，5000 r·min-1离心5 min（离心半径为6 cm），弃去上清液。沉淀物分别用乙醇淋洗各2 次[11]，待溶剂挥干后沉淀物用热水50 mL溶解，置于-20 ℃冰箱保存，作为枸杞粗多糖溶液。

2.2 枸杞粗多糖总糖含量测定

2.2.1 标准曲线的制备 取Glc 对照品约10 mg 置于100 mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得Glc 储备液。分别精密量取Glc 储备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置具塞试管中，分别加水补至2.0 mL后，加入5%苯酚溶液1.0 mL，将溶液充分混匀后滴加硫酸5.0 mL，混合均匀，室温下静置5 min，再水浴加热15 min，后冰浴5 min终止反应。采用紫外分光光度计在490 nm 处测定吸光度（A），空白对照以水代替对照品溶液。最终以Glc 质量浓度为横坐标（X），A为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得Glc线性方程：Y=0.81X-0.039 3（r=0.994 6）。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取枸杞粗多糖溶液1.0 mL，置于20 mL 量瓶中，加水定容，摇匀，得到供试品溶液。

2.2.3 样品含量测定 精密量取供试品溶液0.3 mL置具塞试管中，加水补至2.0 mL后，按2.2.1项下方法测定A值，每个样品重复测定2次，通过Glc线性方程计算样品中总糖含量，22批样品的总糖含量见表2，质量分数为3.24%～8.66%，同时发现宁夏枸杞与北方枸杞在总糖含量上的差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 22批枸杞样品总糖质量分数

2.3 枸杞粗多糖Mw测定

2.3.1 色谱条件 参考文献[12]方法，采用凝胶渗透色谱-示差检测器-光散射法（GPC-RI-MALLS）测定Mw。采用Shodex SB-806 HQ型凝胶柱和Shodex SB-804 HQ 型凝胶柱串联进行分析，流动相为0.1%氯化钠溶液；柱温为40 ℃；柱流速为0.5 mL·min-1；进样量为50 μL。

2.3.2 MALLS 检测条件 石英玻璃样品池，激光波长为658 nm。用甲苯对MALLS 90° PDA 进行校正，用Mw为44 000 右旋糖酐对照品对其余角度检测器进行归一化，折光指数增量值（dn/dc）为0.138。采用GPC-RI-MALLS 测定获得Mw及数均相对分子质量（Mn）值，按公式（1）计算分散系数（PDI）。

2.3.3Mw测定结果 采用GPC-RI-MALLS 测定22批枸杞中提取的粗多糖的Mw及PDI，分别计算3个色谱峰在总峰面积中的占比，结果见表3。22批样品的Mw为0.733×106～3.191×106，PDI 值为3.365～5.550。有报道对LBP 的Mw研究文献进行总结，指出枸杞粗多糖的Mw为1.0×104～2.3×106[13]，这与本研究结果基本一致。

表3 22批样品LBP的Mw、PDI及峰面积占比测定结果

从Mw测定色谱图（图1）来看，枸杞粗多糖在色谱图呈现3 个不完全分离的色谱峰。同时发现，宁夏枸杞与北方枸杞的GPC-RI色谱图存在明显的区别，主要体现在峰2 和峰3 的色谱峰峰面积比例上（表3）。宁夏枸杞色谱图中峰3 对峰2 的面积比为5.40～8.79，北方枸杞峰3 对峰2 的面积比仅为1.30～1.86。

图1 GPC-RI-MALLS测定22批枸杞样品Mw

2.4 LBP单糖组成测定

2.4.1 对照品溶液的制备 参考文献[10]实验方法，分别精密称取对照品Man、Rib、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl和Ara适量，加水制成1.0 mg·mL-1的单标溶液。精密吸取各单标溶液1.0 mL置于10 mL量瓶中，加水制成含9种糖质量浓度约为0.1 mg·mL-1的混合对照品溶液。精密吸取混合对照品溶液500 μL，加0.25 mol·L-1NaOH 溶液75 μL，再加入0.5 mol·L-1PMP 甲醇溶液150 μL，混匀后于70 ℃反应90 min。冷却至室温后加入0.25 mol·L-1HCl溶液75 μL。加三氯甲烷1 mL 萃取，除去下层有机层，重复萃取3次，取上层溶液即得。

2.4.2 供试品溶液的制备 精密量取枸杞粗多糖溶液1.0 mL置于5.0 mL量瓶中，加水定容，制成多糖稀释液，摇匀。精密量取多糖稀释液1.0 mL，置于安瓿瓶中，加入等体积的4 mol·L-1三氟乙酸，密闭，于120 ℃反应4 h。氮气吹干，加甲醇适量，再吹干，以除尽剩余三氟乙酸，加水1.0 mL充分溶解。按2.4.1项下方法“加0.25 mol·L-1NaOH溶液75 μL”起同法处理，即得供试品溶液。

2.4.3 高效液相色谱-光电二极管阵列检测法（HPLC-PDA）检测 采用Zorbax Eclipse XDB 型C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分析，柱温为35 ℃，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为250 nm，进样量为10 μL，流动相为乙腈-0.125 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（16∶84，加入1.0 mol·L-1氢氧化钾溶液调节pH至6.9）。

2.4.4 单糖组成测定结果 选取10 批代表性样品的粗多糖进行单糖组成测定，其中包括北方枸杞3批及宁夏枸杞7批（S1、S2、S14～18），宁夏枸杞分别来源于宁夏、青海和新疆3个产地，结果见图2。

图2 混合对照品和10批枸杞样品单糖组成测定图谱

从图2 可看出，不同产地提取的枸杞粗多糖具有相同的单糖组成，均由9种单糖组成。HPLC 测定图谱中13.61 min处色谱峰为衍生试剂色谱峰，其余色谱峰按保留时间顺序依次为Man、Rib、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl 和Ara。其中，8 号和9号峰，即Xyl和Ara的分离效果与流动相体系的pH相关，当调pH 为6.9 时，其分离效果达到最佳。以9 种单糖混合对照品所得峰面积为对照，分别计算样品中各单糖含量及在总糖中的百分比，结果见表4。枸杞粗多糖中Ara含量最高，平均百分比高达32.2%。同时发现不同产地样品单糖组成含比存在一定差异，尤其体现在宁夏枸杞和北方枸杞的GalA 含量上，7批宁夏枸杞LBP 中GalA 的平均质量分数为21.1%；3 批北方枸杞LBP 成分中GalA 的平均质量分数为11.2%，差异有统计学意义（P＜0.05）。若以样品中Ara 峰面积与GalA 峰面积比作为指标比较宁夏枸杞与北方枸杞差异，发现7 批宁夏枸杞样品比值为1.39～1.69，而北方枸杞的比值为2.61～3.16。

表4 10批枸杞样品LBP中各单糖占比

2.4.5 方法学验证 对单糖组成测定方法的稳定性、重现性、检出限及回收率进行了验证，结果见表5。从表5 结果可以看出，LBP 中9 种单糖的回收率为89.0%～103.9%，重复性结果RSD均小于4.7%。由于单糖组成测定步骤繁杂，需经过水解、除酸和衍生化等步骤，故认为此方法学验证结果可基本满足测定要求。在稳定性试验中发现，6 h 内样品中9种单糖测定结果RSD均小于4.3%，稳定性良好。6 h后样品中GalA 和GlcA 成分的含量明显下降，24 h稳定性测定结果显示2 个成分的RSD 分别达到30.4%和23.4%，稳定性较差。故在实际测定中建议样品衍生化后应在6 h内完成HPLC检测。

表5 LBP中单糖组成测定方法的验证

2.5 单糖组成指纹图谱的建立与分析

2.5.1 指纹图谱建立 将2.4项下测定的10批样品单糖组成数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012A版），确定9个共有峰。

2.5.2 相似度评价 本研究利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012A 版）分析不同产地不同品种样品单糖组成指纹图谱相似度。S17 样品单糖组成含量比接近平均值，故以其色谱图作为参照图谱，样 品S1、S2、S14、S15、S16、S18、S20、S21、S22 的相似度计算结果分别为0.973、0.993、0.984、0.993、0.991、0.985、0.955、0.953、0.958。9 批样品与S17 的相似度均大于0.95，说明枸杞样品虽来自不同地理区域，但单糖组成相似度较高。6 批宁夏枸杞与S17 的相似度在0.97 以上，而3 批北方枸杞与S17 的相似度为0.953～0.958，均低于0.96。故认为通过单糖组成指纹图谱可初步对宁夏枸杞和北方枸杞进行区分。通过10 批样品测定，初步建立了宁夏枸杞和北方枸杞单糖组成对照指纹图谱，见图3。

图3 LBP中单糖组成的HPLC指纹图谱

3 讨论

现行枸杞标准仅测定总糖含量，难以反映不同种和不同产地LBP 成分的差异性。为了深入探索不同品种及不同产地LBP 的差异性，本研究分别从宁夏、青海、新疆、河北种植基地收集了共22批枸杞样品进行提取纯化，并对其初级结构进行测定。收集的宁夏枸杞样品主要为“宁杞1号”。据已有报道，目前宁夏枸杞种植面积突破200 万亩（1 亩≈666.67 m2），其中80%以上种植品种为“宁杞1 号”，主要分布于宁夏、甘肃、青海、新疆等地[9]。故本研究中收集“宁杞1 号”样品更能代表市场主流产品的质量情况。在初级结构测定方面，主要对Mw和单糖组成进行测定和比较。在多糖研究中一般认为单糖组成和Mw对多糖生物活性有较大的影响，如在LBP 文献报道中，有学者指出其糖醛酸含量对其活性有重要影响[14-15]。前期本课题组研究亦发现Mw与LBP 活性密切相关[16]。

本研究对Mw的测定采用了GPC-RI-MALLS。植物多糖Mw的常用测定方法包括MALLS、GPC-RI 及基质辅助激光解析串联飞行时间质谱法（MALDITOF-MS）。例如，Hu 等[17]以右旋糖酐为对照品，采用GPC-RI对短柄五加中多糖成分的Mw进行了测定；Yu 等[18]亦采用GPC-RI 对西洋参中多糖成分的Mw进行了测定；陈同强等[19]采用GPC-RI-MALLS 对红芪多糖的相对分子质量进行了检测；胡坪等[20]采用MALDI-TOF-MS 对麦冬中多糖成分的Mw进行了测定。本研究中采用的MALLS 是一种相对分子质量的绝对测定方法，其原理是利用激光照射到样品在各个方向产生散射光，光散射强度与Mw和溶液的质量浓度成正比，从而对相对分子质量进行计算。已有研究采用GPC-RI-MALLS对制备的50批LBP进行测定[7]，结果表明此方法准确快速，可作为LBP 的Mw测定方法。单糖组成则采用PMP 柱前衍生化结合HPLC-PDA 进行检测，PMP 是常用的柱前衍生化试剂，其优势在于与还原糖在碱性条件下反应后所得衍生化产物较为稳定，且无立体异构峰，便于分析。从实验结果可以看出，此方法前处理操作重复性较好，且经衍生化的9种单糖检测限均低于20 μg·mL-1，灵敏度较高。为了进一步分析不同产地LBP 的差异性，本研究建立了单糖组成指纹图谱并结合相似度对不同样品进行分析。选择了单糖组成较接近7 批宁夏枸杞单糖组成测定平均值的S17 样品作为参照指纹图谱。在LBP 的研究中，已有学者采用指纹图谱对其单糖组成相似度进行分析[8]，其研究目的是比较不同产地宁夏枸杞中多糖组分差异，故收集的样品均为宁夏枸杞样品。结果表明，不同产地宁夏枸杞中多糖组分的单糖组成高度相似，与本研究测定结果一致。

以上研究初步得出结论，通过多糖成分测定可有效区分宁夏枸杞和北方枸杞，主要差异性指标包括：1）总糖含量，宁夏枸杞的总糖含量高于北方枸杞（P＜0.05）；2）Mw测定GPC-RI 色谱图，不同相对分子质量段的色谱峰面积存在显著差异（峰2 与峰3 面积比）；3）单糖组成测定表明北方枸杞的GalA 含量明显低于宁夏枸杞，以Ara与GalA 含量比作为指标值，可有效区分不同枸杞品种。之所以选择GalA 是因为其是宁夏枸杞和北方枸杞含量差异最大的成分，而Ara是枸杞中最主要成分，故选择这2个成分比值能更准确地表达两者的差异。综上所述，不同产地宁夏枸杞中多糖成分结构高度一致，但宁夏枸杞与北方枸杞中粗多糖成分存在较大差异，进一步说明基于多糖成分对枸杞进行质量评价的必要性。同时，本研究建立的方法可通过测定多糖成分初步区分宁夏枸杞与北方枸杞，可为完善枸杞质量控制方法和枸杞资源评价提供参考。