RNF180基因甲基化是胰腺癌的潜在诊断标志物

李 昕， 段一梦， 张美英， 郭明洲

1．郑州大学基础医学院，河南 郑州 450001； 2.中国人民解放军总医院第一医学中心消化内科医学部

胰腺癌是最致命的癌症之一，死亡率极高。尽管其他肿瘤患者的存活率有了一定的提高，但自20世纪60年代以来，胰腺癌患者的存活率一直保持相对不变[1-2]。目前手术切除是其唯一的治愈机会。不幸的是，80%～85%的患者发现时已失去手术切除机会。此外，胰腺癌对大多数化疗及分子靶向治疗反应不佳[3]。随着人口的老龄化，胰腺癌的发病呈快速增长趋势，50岁以后发病率开始增加，70岁达到高峰。5%～10%的患者具有遗传倾向，一些具有遗传综合征的特征性基因突变是胰腺癌的危险因素，如BRCA1/2(乳腺和卵巢癌综合征)、ATM(共济失调性毛细血管扩张症)、STK11(Peutz-Jeghers综合征)、PRSS1(遗传性胰腺炎)、MLH1和MSH2/6(Lynch综合征)[4]。另外，饮酒和吸烟也是胰腺癌的危险因素[5]。胰腺癌主要分为两型：胰腺腺癌占95%，胰腺内分泌肿瘤约占5%(<5%)[6]。由于胰腺癌早期缺乏典型的症状，其早期诊断仍是一个挑战。对进展期胰腺癌FOLFIRINOX方案[5-fluorouracil、Folinic acid (Leucovorin)、Irinotecan、Oxaliplatin]和吉西他滨(Gemcitabine)结合白蛋白紫杉醇(Nab-paclitaxel)是目前的主要治疗手段[7]。尽管免疫治疗在其他肿瘤中获得了一定的效果，但在胰腺癌中的疗效非常有限[8]。由于许多信号通路参与细胞命运的调控，且这些通路之间存在复杂的交叉互通现象(crosstalking)，针对单一异常通路的靶向治疗常常效果不佳。另外，由于胰腺癌的高度异质性也决定了针对单一通路的治疗效果有限[4，9-11]，因此，需要深入研究胰腺癌的分子调控网络，从而获得高效、特异的“协同致死”治疗靶标。近年来，随着人们对表观遗传认识的深入，以表观遗传为基础的“协同致死”取得了一些新的进展[11-17]。在胰腺癌中分离和鉴定新的表观遗传异常的标志物将会提供更多新的治疗策略。

环指蛋白180(ring finger protein 180,RNF180)是一种新发现的环指蛋白家族的成员，该基因位于人类染色体5q12.3，该区域在许多肿瘤中均发生缺失[18-19]。在胃癌和肝癌中频繁发生甲基化，RNF180甲基化与幽门螺杆菌感染和胃癌的预后差相关[20-23]。最近的研究发现，RNF180具有E3泛素连接酶活性，其通过下调RAD51增加三阴性乳腺癌对吉非替尼的敏感性[24]。RNF180在胰腺癌中的表达及其调控机制目前尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 胰腺癌细胞系及组织标本本实验涉及9个胰腺癌细胞系(CFPAC1、Panc5.04、PANC1、T3M4、MIAPaCa2、SW1990、Panc10.05、PANC3.11和AsPC1)均是已建立的原发性胰腺癌患者的细胞系。细胞培养基为RPMI 1640包含1%青霉素-链霉素，10%胎牛血清。细胞均在体积分数为5% CO2和温度为37 ℃条件下进行培养。1∶3进行细胞传代培养12 h后，向培养基中加入5-aza-dc使其终浓度为2 μmol/L，每24 h更换新的含有2 μmol/L 5-aza-dc的RPMI 1640培养基，药物处理96 h后，提取细胞总RNA。本实验采用的112例胰腺癌组织和8例非癌患者的正常胰腺组织均来自中国人民解放军总医院。取材的所有患者术前均未接受任何放化疗等治疗，术后病理检查均证实为原发性胰腺癌。本研究获得中国人民解放军总医院伦理委员会批准(批号：20090701-015)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞总RNA提取与半定量RT-PCR检测：取对数生长期细胞，提取总RNA后，经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和质量。取5 μg总RNA用Thermo Scientific RevertAid RT逆转录试剂盒合成cDNA溶液，作为后续PCR反应的模版cDNA，用去离子水稀释至100 μl，取2.5 μl的cDNA模板在25 μl反应体系中进行PCR扩增。RNF180 RT-PCR引物序列为：5′-CTCCGGGACGTGGATACAGAT-3′(上游引物)，5′-GGGCTTTTTGGATTAGGCAGC-3′(下游引物)，扩增产物长度为254 bp。RNF180 RT-PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(3个循环)；94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(3个循环)；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(3个循环)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(26个循环)；72 ℃ 7 min。GAPDH RT-PCR引物序列为：5′-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(上游引物)，5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(下游引物)，扩增产物长度为454 bp。GAPDH RT-PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(25个循环)；72 ℃ 7 min。取10 μl PCR扩增产物于2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 DNA的提取、甲基化特异性PCR(methylation specific polymerase chain reaction，MSP)：将对数生长期细胞采用酚/氯仿法抽提DNA，最后溶于ddH2O。取2 μg DNA经亚硫酸氢钠硫化后，采用DNA纯化试剂盒纯化，最后溶于20 μl的ddH2O，-20 ℃冰箱保存[25-26]。RNF180启动子区特异性甲基化PCR引物序列为：5′-TCGGGGTTGTTAGGTATAGTTCGAGC-3′(甲基化上游引物)，5′-AACTCTAAAAACTCGCTACGACTCCG-3′(甲基化下游引物)，扩增产物长度为111 bp。RNF180启动子区特异性非甲基化PCR引物序列为：5′-GGTTGGGGTTGTAGGTATAGTTTGAGT-3′(非甲基化上游引物)，5′-CAAACTCTAAAAACTCACTACAACTCCA-3′(非甲基化下游引物)，扩增产物长度为115 bp。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(35个循环)；72 ℃ 7 min。取10 μl PCR扩增产物于2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行数据分析。使用χ2检验分析RNF180甲基化率与胰腺癌患病相关因素的相关性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNF180在胰腺癌中的表达受启动子区域甲基化的调控在胰腺癌细胞CFPAC1、Panc5.04和PANC1细胞中RNF180基因高表达，在MIAPaCa2和T3M4细胞中表达降低，而在SW1990、Panc10.05、PANC3.11和AsPC1细胞中表达缺失。MSP结果显示，RNF180基因启动子区在CFPAC1、Panc5.04和PANC1细胞中呈非甲基化状态，在MIAPaCa2和T3M4细胞中部分甲基化，在SW1990、Panc10.05、PANC3.11和AsPC1细胞中完全甲基化。这些结果表明，RNF180基因启动子区域甲基化与其表达水平密切相关。然后，应用去甲基化药物5-aza-dc处理胰腺癌细胞，发现RNF180在非甲基化的细胞(CFPAC1、Panc5.04和PANC1)中表达水平无明显改变，部分甲基化细胞(MIAPaCa2和T3M4)其表达水平增加，完全甲基化细胞(SW1990、Panc10.05、PANC3.11和AsPC1)恢复其表达(见图1)。以上结果表明，RNF180基因的表达受启动子区甲基化调控。

注：ddH2O：体系阴性对照；GAPDH：内参对照；(-)：5-aza-dc处理前；(+)：5-aza-dc处理后。NL：正常淋巴细胞DNA，非甲基化对照组；IVD：体外甲基化DNA，甲基化对照组；H2O：体系阴性对照；U：非甲基化；M：甲基化。

2.2 RNF180在胰腺癌组织中频繁发生甲基化为探讨RNF180基因在原发性胰腺癌中的甲基化情况，应用MSP方法检测了112例原发性胰腺癌及8例非癌患者正常胰腺组织。RNF180基因在非癌患者正常胰腺标本中未发现甲基化，排除了组织特异性甲基化的可能性。在112例原发性胰腺癌组织中，35例发生甲基化，77例未发生甲基化，甲基化率为31.25%(35/112，见图2)。进一步的分析发现，RNF180甲基化与胰腺癌的TNM分期有相关性(P<0.05)，与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、肿瘤分化、淋巴结转移、神经侵犯、吸烟、饮酒等因素无相关性(P均>0.05，见表1)。

注：M：甲基化，U：非甲基化，PN：正常胰腺组织，PC：胰腺癌组织。

表1 RNF180甲基化与原发性胰腺癌临床因素的关系Tab 1 The association of RNF180 methylation with clinical factor in primary pancreatic cancer

3 讨论

RNF180在胃癌和肝癌频繁发生甲基化，且在结肠癌、胃癌和乳腺癌中影响肿瘤的生长和转移[21，23-24，27-28]。RNF180在胃癌中通过E3泛素化酶的作用发挥翻译后调控，从而影响肿瘤的发生和进展，是胃癌预后不良的独立预后因素[28]。在三阴性乳腺癌中，RNF180通过下调RAD51降低对吉非替尼的敏感性[24]。我们在胰腺癌中发现，RNF180频繁发生甲基化，且其表达受启动子区甲基化调控。RNF180甲基化与肿瘤的分期相关，而与其他临床因素之间的关系差异无统计学意义，这些结果表明RNF180甲基化可能是食管癌预后不良的因素。样本量相对较小是本研究的局限性。我们拟在未来的研究中扩大样本量并增加癌前病变病例进一步分析。因为RNF180参与RAD51的调控，我们拟在未来的研究中探讨RNF180是否参与DNA损伤修复机制。最终明确RNF180能否成为胰腺癌早期诊断的标志物和治疗靶标。

RNF180基因在人类胰腺癌频繁发生甲基化，其表达受启动子区域甲基化调控。RNF180甲基化是胰腺癌潜在的诊断和预后标志物。