采用高通量测序技术分析宝丰清香型白酒大曲的真菌多样性

赵志军，郜燕燕，刘延波，葛少华，孙秋丽，刘 宁，王晓江，孙西玉，潘春梅

(1.河南牧业经济学院 酒业学院 河南 郑州 450046；2.宝丰酒业有限公司 河南 平顶山 467500； 3.河南省宁陵县综合检验检测中心 河南 商丘 476700)

中国白酒是世界上最古老的蒸馏酒之一，具有悠久的历史传承和深厚的文化内涵[1]。白酒香型众多，其中清香型白酒具有清香纯正、醇甜柔和等特点[2]，是我国白酒三大基本香型之一[3]。宝丰酒作为地方名酒，是清香型白酒的典型代表，在中原区域内具有一定的销量和知名度。

大曲是多菌多酶的复合体系[4]，含有十分丰富且复杂的微生物和酶[5]，这些微生物和酶关系到酒体香气的呈现及香味前体物质的形成，进而影响白酒的品质[6]。根据培曲工艺和成曲性质的不同，清香型白酒大曲可分为清茬(QC)、红心(HX)和后火(HH)三种[7]。在三种大曲生产中，使用的原材料相同，仅培曲温度和技术操作略有差异，造成不同曲种内的微生物特征和发酵特性各具特色[8]。大曲中的霉菌为酿造提供糖化力、液化力、蛋白质分解能力，生成多种有机酸，决定着大曲多方面的质量特性。酵母菌是大曲发酵力的主要来源，是大曲微生物菌系中重要的菌群之一，主导酒精的产生，影响醇类、酸类、酯类、酮类、酚类等风味化合物的形成[9,10]。不同的微生物形成不同的大曲菌系结构，其代谢产生的各种酶类构成大曲的酶系，不同地域微生物群落组成差异使得不同地域的白酒酒曲带有明显的地域特色[11]。因此，认识宝丰清香型白酒三种大曲的真菌群落结构特征对清香型白酒的发酵生产具有十分重要的意义。

随着分子生物学技术的不断发展和成熟，大曲微生物的研究在传统微生物分离培养方法的基础上增加了依靠分子生物学技术的免培养方法[12,13]。高通量测序技术作为微生物研究的免培养方法之一，具有通量高、成本低、准确率高等优点[14]，在微生态研究领域得到广泛应用[15]。酒曲微生物复杂、种类繁多，尤其需要借助高通量测序技术从微生态学角度开展多样性研究[16,17]。

本试验采用高通量测序技术，对宝丰酒清茬、红心、后火三种大曲的真菌种类、丰度以及群落结构差异进行研究，确定其优势菌群，为进一步解析中原地区清香型白酒大曲中的功能性微生物以及从大曲中筛选优良酿酒菌种奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

清茬曲、红心曲和后火曲取自宝丰酒业有限公司生产的成品曲，批号为190613B。Hi-Pure Soil DNA Kits(土壤DNA提取试剂盒，型号D3142)购自广州美基生物科技有限公司。PCR有关试剂为TOYOBO公司产品。回收纯化试剂为美国贝克曼库尔特公司产品。

1.2 ITS基因序列扩增及高通量测序

按Hi-Pure Soil DNA Kits试剂盒说明书步骤提取基因组DNA，用Nanorop微量分光光度计检测核酸的OD值，测定核酸的纯度，用琼脂糖凝胶电泳检验核酸样本的完整性。

从样本中提取得到的基因组DNA经质量检测合格后，用带有barcode的特异引物扩增其ITS的ITS2区。所用引物序列为：ITS3-KYO2，GATGAAGAACGYAGYRAA；ITS4，TCCTCCGCTTATTGATATGC。将PCR扩增产物切胶回收，使用Quanti Fluor TM荧光计进行定量。将纯化的扩增产物等量混合，连接测序接头，构建测序文库，上机测序。

1.3 数据处理与分析

本试验数据通过Illumina Hiseq2500 PE250高通量测序平台分析完成。

测序得到的原始下机数据依次使用FASTP(v 0.18.0)、FLASH(v1.2.11)、Qiime(v 1.9.1)、Mothur(v 1.34.0)、Uparse(v 9.2.64)进行Illumina测序数据校正、拼接、Tags质控、去冗余处理及序列聚类。

用Qiime(v 1.9.1)软件进行稀释曲线分析。对OTU结果进行Alpha多样性分析。利用物种分布堆叠图直观展示群落中不同分组的物种组成情况。采用R语言Venn Diagram包(v 1.6.16)进行维恩图分析，直观展示样品间OTU情况。使用R语言Vegan包(v 2.5.3)进行主坐标分析(PCoA)，展示样品间多样性差异。使用LEFSE(LDA effect size)(v 1.0)软件对组间(≥2组)所有物种进行LEFSE分析，了解组间菌群差异。

2 结果与分析

2.1 稀释曲线分析

基于97%水平下OTU的丰度信息，使用稀释曲线和Shannon指数曲线对清茬曲、后火曲和红心曲真菌多样性进行评估。根据样品稀释曲线来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，当曲线走势逐渐趋于平缓或者达到平台期时就可以认为测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种，反之，则表明样品中物种多样性较高，随着测序深入还可能产生较多的新OTU。Shannon指数曲线反映样本中微生物的多样性，利用各样本测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的微生物信息。

由图1、图2可知，Sobs指数稀释曲线随序列数增加表现为先增加后趋于平缓的趋势，表明测序已趋于饱和，增加测序数据无法再找到更多的OTU。Shannon指数曲线在测序序列数>10000时，Shannon指数稀释曲线已经进入平台期，说明测序数据量已足够大，可以反映样品中绝大多数生物的物种信息。

图1 真菌Sobs指数稀释曲线

图2 真菌Shannon指数曲线

2.2 组间样品Alpha多样性分析

Sobs指数、Shannon指数、ACE指数、Chao1指数、Simpson指数和Coverage指数是常用于描述微生物群落物种多样性的Alpha多样性指数。这六个多样性指数可以对群落物种组成的丰富度以及群落物种组成的均匀度进行综合性的评价[18]。Sobs、Chao1、ACE指数主要关心样本的物种丰富程度，其中Sobs表示检测到的OTU个数，Chao1和ACE表示预测的OTU个数。Coverage反映样本的测序饱和度。Simpson、Shannon综合体现物种的丰富度和均匀度，故指数的高低还会受均匀度影响，样本中的物种分布越均匀，多样性越高。

由表1可知，清茬曲的Sobs指数、Chao1指数、ACE指数均高于后火曲和红心曲，说明清茬曲的真菌群落物种丰富度较后两者高而多样性低于后两者。三组样品的Coverage指数均在0.998 8～0.999 1之间，说明对各样本文库数据达到了较高的覆盖率，样本中的序列基本被测出，测序结果可信度高，能够如实反映样品真菌群落的组成。

表1 三组样品真菌Alpha多样性指数

2.3 真菌物种组成分析

Uparse(version 9.2.64)在构建OTUs的过程中会选取代表性序列(OTUs中丰度最高的那条Tag序列)，将这些代表性序列集合，用RDP Classifier(version 2.2)的Naïve Bayesian assignment算法，与UNITE(version 8.0)数据库进行物种注释(设定置信度的阈值为0.8～1.0)。

挑选在所有样本中的丰度均值排名前10的物种详细展现，其他已知物种归为Others，未知物种标记为Unclassified。

由图3可知，清茬曲、红心曲和后火曲的真菌菌群共注释到具有明确分类地位的门有四个，分别是Ascomycota(子囊菌门)、Mucoromycota(毛霉门)、Basidiomycota(担子菌门)、Chytridiomycota(壶菌门)，同时有未知真菌菌门存在。其中Ascomycota(子囊菌门)在清茬曲、红心曲和后火曲中的优势较为明显，在三种曲中的相对丰度分别达到99.92%、95.57%和99.83%。Mucoromycota(毛霉门)在后火曲中的相对丰度为4.40%。

图3 真菌在门水平上的分布

由4可知，清茬曲、红心曲和后火曲的真菌菌群共注释到具有明确分类地位的属有十个，分别是Thermoascus(热子囊菌属)、Aspergillus(曲霉属)、Rasamsonia(罗山松属)、Rhizopus(根霉属)、Monascus(红曲霉属)、Candida(假丝酵母)、Issatchenkia(伊萨酵母属)、Symbiotaphrina、Cyberlindnera、Saccharomyces(酵母属)，同时存有其他已知真菌菌属和未知真菌菌属。其中Thermoascus(热子囊菌属)在清茬曲、红心曲和后火曲中的优势地位明显，其相对丰度在清茬曲中达到了89.64%，明显高于红心曲(53.52%)与后火曲(57.06%)。在属水平上，不同大曲间真菌的组成上有明显差异。在清茬曲中，Thermoascus(热子囊菌属)为优势菌属，其次是Aspergillus(曲霉属)(2.50%)；在红心曲中，Thermoascus(热子囊菌属)为优势菌属，其次是Rasamsonia(罗山松属)(15.83%)、Aspergillus(曲霉属) (15.28%)，再次是Rhizopus(根霉属) (4.40%)、Monascus(红曲霉属) (3.70%)；在后火曲中，Thermoascus(热子囊菌属)为优势菌属，其次是Aspergillus(曲霉属) (38.13%)。

图4 真菌在属水平上的分布

2.4 OTU分布Venn分析

使用R语言Venn Diagram包(version 1.6.16)对从不同大曲样品获取的OTU进行统计学分类，以Venn图直观显示不同大曲样品中特有以及共有的OTU数量。

由图5可知，清茬曲、后火曲与红心曲分别检测到226个、231个与229个真菌OTU，其中共有的OTU有152个，分别占清茬曲、后火曲和红心曲OTU总数的67.26%、65.80%和66.38%，占各组样品OTU数比例较大。清茬曲独有的OTU有42个，占清茬曲OTU总数的18.58%；后火曲独有的OTU有35个，占后火曲OTU总数的15.15%；红心曲独有的OTU有35个，占红心曲OTU总数的15.28%。

图5 三组样品的OTU分布Venn图

2.5 PCoA分析

使用R语言Vegan包(version 2.5.3)，在OTU水平上基于Bray-curtis算法得到的距离指数，对各处理样品物种进行PCoA分析(Principal Co-ordinate Analysis，主坐标分析)，PCoA是基于距离矩阵而进行的降维分析，以百分比评估各坐标轴对菌群结构总体差异的解释度，一般PCo1和PCo2总和达到50%以上较好。

图6中的圆点代表单个样品，不同颜色代表不同的分组，相似度高的样品在一个范围内显著聚集。图中主坐标PCo1和主坐标PCo2对菌群结构总体差异的解释度分别达到56.16%和28.64%，合计84.80%(>50%)，可视为差异的主要来源。通过对三种大曲的PCoA分析发现，受主坐标PCo1影响，清茬曲与红心曲、后火曲的真菌菌群结构存在明显差异，红心曲与后火曲的真菌菌群结构更相似。

2.6 指示物种分析

使用LEFSE(version 1.0)软件对组间所有物种进行LEFSE分析，输出LDA柱状图(图7)(默认阈值：LDA>2)以及进化分支图(图8)，找出各组间特异的主要菌群。

图7 LDA柱状图

图8 进化分支图

LDA柱状图展现了清茬曲、红心曲和后火曲中具有显著性差异的真菌微生物，柱的长度代表差异物种的影响值大小。清茬曲中的Thermoascus-aurantiacus(橙色嗜热子囊菌)对比红心曲、后火曲具有显著性差异；后火曲中的Asperillus-montevidensis(蒙地曲霉)、Microascus-senegalensis、Hyphopichia(生丝毕赤酵母属)、Hyphopichia-burtonii(伯顿生丝毕赤酵母)、Debaryomycetaceae、Millerozyma-farinosa(粉酵母菌)对比清茬曲、红心曲具有显著性差异；红心曲中的Rasamsonia-composticola、Trichocomaceae(发菌科)、Rhizopus-arrhizus(无根根霉)、Mucorales、Mucoromycetes、Mucoromycota、Thermoascus-crustaceus(坚脆嗜热子囊菌)、Monascus-purpureus(紫红曲霉)、Monascus(红曲霉)、Candida-glabrata(光滑假丝酵母)、Cyberlindnera-fabianii(费比恩塞伯林德纳氏酵母)对比清茬曲、后火曲具有显著性差异。

3 讨论

依赖于形态、生理生化特性进行分类鉴定的传统微生物培养分离方法，所得到的微生物仅占微生物总数的0.1%～10%[19]，无法解析微生物的组成及丰度，无法全面深入地反映大曲真菌菌群结构的完整性。

本试验采用Illumina Hiseq2500 PE250测序平台分析宝丰清香型白酒的清茬、红心、后火三种大曲中的真菌微生物的群落结构和多样性，结果表明清茬曲的物种多样性较红心曲和后火曲高，而丰富度是三者中最低的。通过物种分析表明，在门水平上三种大曲的优势真菌菌门均为Ascomycota(子囊菌门)；在属水平上，清茬曲的优势真菌菌属为Thermoascus(热子囊菌属)，红心曲的优势真菌菌属为Thermoascus(热子囊菌属)、Rasamsonia、Aspergillus(曲霉属)；后火曲的优势真菌菌属为Thermoascus(热子囊菌属)、Aspergillus(曲霉属)。三种大曲共有的OTU在各个大曲中所占比例均超过65%，各个大曲独有的OTU占比均未达到20%，说明三种大曲之间的菌群结构差异性较小。主坐标分析中，清茬曲与后火曲、红心曲在PCo1轴上分离开来，说明真菌的群落结构在制曲的各阶段变化规律有所不同，其中后火曲与红心曲的群落结构更为相似。LEFSE分析得到了清茬曲、红心曲和后火曲中的主要差异菌群，这些菌群也是形成大曲功能差异的主要原因。

周森等[11]对北京、山西、台湾、黑龙江、河北的11份清香型白酒大曲样本进行微生物种群多样性分析，结果表明11种大曲真菌多样性较为一致，扣囊覆膜酵母是优势真菌。张双燕等[18]对北京清香型白酒大曲微生物多样性的研究表明，真菌中的优势菌是假丝酵母属，此外还有曲霉属、毛霉属、威克汉姆酵母属等。罗惠波等[20]对山西汾酒清茬曲、红心曲和后火曲的真菌群落结构的比较研究表明，清茬曲的优势真菌为毕赤酵母属和根霉属，红心曲的优势真菌为根霉属和横梗霉属，后火曲的优势真菌为毕赤酵母属。本试验表明，宝丰酒清茬曲的优势真菌为Thermoascus(热子囊菌属)，红心曲的优势真菌为Thermoascus(热子囊菌属)、Rasamsonia、Aspergillus(曲霉属)，后火曲的优势真菌为Thermoascus(热子囊菌属)、Aspergillus(曲霉属)，说明中原地区的清香型白酒大曲的优势真菌与其他地区存在差异。

本试验通过对宝丰清香型白酒大曲真菌微生物的解析，对其真菌多样性、优势种群的分布、群落结构差异以及数量关系有了一定的了解，为中原地区清香型白酒大曲真菌微生物的研究提供了参考。