QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时检测草莓中4种农药残留量

杜 鑫，彭海燕，覃明丽，陈绍辉，易珊珊，蒋金芳

(南充农产品质量监测检验中心，四川 南充 637000)

草莓酸甜美味，果肉色泽红润，富含丰富的蛋白质、维生素、糖分、有机酸、食物纤维及矿物质等多种营养物质，深受消费者喜爱，已成为广大市民最普遍食用的水果品种[1]。草莓主要以大棚覆膜种植技术为主，棚内高温高湿环境极易引起病虫害的发生，降低草莓的品质和产量。噻螨酮、唑螨酯、噻嗪酮、阿维菌素等杀虫杀螨剂具有选择性强、速效性好、持效期长及对蜜蜂无不良影响等特点，已用于多种植物上防治红叶螨、全抓蟠和其他植食性螨类，可用于防治大棚草莓生长过程中的白粉病、霜霉病、二斑叶螨、小菜蛾及红蜘蛛等病虫害[2-4]。

目前，针对果蔬中农药多残留的检测方法主要有气相色谱法[6]、气相色谱—串联质谱法( GC-MS/MS)[7-8]、液相色谱法[9-10]、液相色谱—串联质谱法(LC-MS/MS)[4-5]，但气相色谱法和液相色谱法易受杂质干扰，且前处理繁琐，GC-MS/MS常用于分析弱极性且具有一定挥发性的农药，不适用于检测诸如阿维菌素等难以气化的高沸点物质。超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS) 具有高分辨、抗干扰能力强及高灵敏度等优点，QuEChERS被广泛应用于样品基质的提取、净化，具有操作简易、溶剂用量少、分析速度快等优点，两者结合应用已成为农药和兽药多残留分析的主导技术[11-12]。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂 Waters ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQ-S超高效液相色谱串联质谱仪，GD16plus高速研磨均质仪，H2100R 落地式高速冷冻离心机，Multi Reax全能型振荡器、ML802型分析天平，3-18KS型高速冷冻离心机，Vortex Genius 3型旋涡混合器，JB3060食品调理机。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵均为色谱纯，QuEChERS分散萃取试剂盒(5982-5056)及萃取盐包(5982-0032)。噻螨酮、唑螨酯、噻嗪酮、阿维菌素等4种农药标准溶液，浓度均为1 000mg/L。15/50mL离心管，PTFE 0.22μm针筒式微孔滤膜，蒸馏水。

1.2 样品制备 草莓(红颜、巧克力、奶油、红玉等)，取有代表性的草莓全果(去柄)样品，采用四分法缩分后约1kg，放入料理机中，高速匀浆均质后装入洁净的聚乙烯塑料样品盒中，密封后于-20 ℃冰箱保存(使用前先解冻至室温)。

1.3 样品提取 准确称取10g(精确至0.01g)匀浆后的草莓样品于50mL离心管中，依次加入1颗陶瓷均质子，10.00mL乙腈，一袋萃取盐包，拧紧离心管盖，放入低温(5℃)高速研磨均质仪中3 000r/min均质提取3min，然后5 000r/min离心3min，取上清液待净化。

1.4 样品净化 吸取5mL上清液加到内含900mg MgSO4+150mg PSA塑料离心管中，振荡涡旋2min，5 000r/min离心3min，吸取2mL上清液过0.22μm微孔滤膜后装瓶，待上机测定。

1.5 仪器检测条件

1.5.1 色谱条件 Waters XBridge C18色谱柱(3.5μm，100mm×3.0mm)，柱温40℃，样品室温度为18℃，进样体积为1.00μL；选用甲醇(A)、水(含0.10%甲酸—5mmol/L乙酸铵)(B)及乙腈(C)作为流动相，按(表1)中的流动相梯度洗脱程序分离目标物。

1.5.2 质谱条件 电喷雾离子源的温度为150℃，毛细管电压为3.0kV。脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气，脱溶剂气流量为1 000L/h，其温度为550℃，锥孔气流量为150L/h，碰撞气用高纯氩气，其流量为0.14mL/min。采用电喷雾正离子模式(ESI+)和选择多反应监测(MRM)模式采集数据，质谱仪信号采集时间段为3.5～8.5min，利用质谱已在线切换阀将其他时间段的液相色谱流动相切换到废液，降低质谱检测器污染。

表1 超高效液相色谱流动相梯度洗脱程序

1.6 标准溶液的配制 准确移取各农药标准溶液，用色谱级乙腈逐级稀释成浓度为10mg/L标准储备液，于4℃下避光储存(使用前放至室温)。将筛选出的草莓空白样品按前处理方法制成基质空白溶液，用该溶液逐级稀释10mg/L混合标准溶液，配制成质量浓度为0.005、0.010、0.050、0.10、0.20mg/L一系列匹配标准工作溶液。

2 结果与分析

2.1 色谱-质谱条件优化 将4种农药分别用乙腈-水(1：1，V：V)配制成0.5mg/L浓度的单一标准溶液。选取甲醇(A相)、水(B相)和乙腈(C相)为流动相。在ESI+电离模式下，为提高4种农药的电喷雾离子化效率，采取向水相中加入少量甲酸和乙酸铵。

表2 4种农药的UPLC-MS/MS质谱分析参数

采取质谱进样，在ESI+模式下，手动优化毛细管电压，锥孔电压等，结合不同流动相体系对4种农药进行了全扫描，分析目标物响应信号强度，结合仪器“Intellistart”功能快速优化出的质谱分析参数(表2)。试验发现，在酸性条件下，阿维菌素的准分子离子主要以[M+Na]+形式出现，可能是因为其分子结构中的醚键及羰基上的氧易与Na+结合，整个流路体系中极少的Na+都会与之结合形成[M+Na]+峰[5]，其余3种农药[M+H]+离子峰响应信号较强，将其作为母离子，每种农药筛选出2个响应信号强且没有干扰的子离子，并选用响应信号最强的分子离子对作为定量离子对。

采用色谱进样，为提高目标物分离效果和改善峰形，在0.1%甲酸-水溶液中加入乙酸铵缓冲液，考察其浓度在1～10mmol/L范围变化对目标物的影响。当乙酸铵浓度太低时，不能有效调整峰形，太高了又会抑制目标物的电离，降低灵敏度。当加入5mmol/L乙酸铵时，改善峰形和提高灵敏度的效果最好，优选后的流动相色谱条件(表1)，4种农药的试剂标准溶液MRM色谱图(图1)。结果表明，在优化后的色谱和质谱检测条件下，采用甲醇-乙腈-水体系，目标物均在10min内出峰，加入少量甲酸和乙酸铵后，目标物都有较强的分子离子峰强度，峰形对称，有效提高了检测方法的稳定性、灵敏度和选择性。

图1 4种农药的试剂标准溶液MRM色谱图(0.050mg/L)

2.2 提取剂选择 草莓中有糖类、色素、维生素、有机酸及大量水分，为更充分地提取待测药物，试验选用能与水互溶的乙腈和甲醇为提取剂。经多次试验尝试发现，甲醇的提取效果虽不错， 但没有有效的方法能够分离草莓中的大量水分，而乙腈对不同极性农药均有较好的提取效果， 对试样中油脂和色素类杂质的溶解度较小，利用盐析法又能与水两相分离，还可以除掉草莓样品提取液中的糖类、有机酸物及维生素等大部分杂质，有利于下一步净化提取液，减弱样品基质干扰，降低基质效应影响。经优化后，选用10.00mL乙腈为提取剂。

2.3 QuEChERS 净化方法的选择 QuEChERS主要以N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳(GCB)和十八烷基键合硅胶(C18)等填料为固相吸附剂，固相填料的组成及含量是决定样品净化效果的主要因素。PSA有比氨基柱更强的离子交换能力，可与金属离子产生螯合作用，广泛用于植物农残分析，去除脂肪酸、有机酸、极性色素和金属离子等。GCB主要用于吸附除去样品提取液的大量色素，同时也会对提取液中类似于平面型结构的农药分子有吸附，导致回收率大幅降低。C18主要用于除去脂肪类等非极性化合物。因草莓样品中脂肪含量极少，本实验未选用C18填料，直接选用PSA及PSA+GCB组合的两种净化管。选取空白草莓(红颜)为基质，添加农药含量为0.050mg/kg，乙腈提取后离心，吸取5mL上清液，加入以900mg MgSO4+150mg PSA和885mg MgSO4+150mg PSA+1mg GCB为固相分散剂的15mL净化离心管，涡旋振荡2min，离心后过滤膜上机，计算分析加标回收率来考察净化效果，结果(图2)。

图2 不同净化填料对目标物回收率的影响

结果表明：仅用PSA净化提取液时，4种农药的回收率均接近100%，回收率很好。用PSA+GCB净化后，阿维菌素的回收率降低为76.9%，这是因为阿维菌素是一种含有十六元大环的内酯化合物，易被GCB填料吸附导致。另外，在前处理过程中也发现，经 PSA 净化后的提取液已经变为无色，因此不需要再加入GCB去除色素。综合考虑，用900mg MgSO4+150mg PSA填料净化管处理样品，草莓基质空白及基质标液MRM色谱图(图3)和(图4)，净化后的基质空白不干扰试样中的目标物测定，目标物响应良好，峰形对称且无杂质，满足定性定量分析要求。

图3 草莓空白基质MRM色谱图

图4 4种农药的基质标准溶液MRM色谱图(0.050mg/L)

2.4 基质效应的影响 基质效应(微乳剂)是液质联用检测方法检测中普遍存在的现象，指样品中目标分析物的浓度或者质量检测受一种或多种不被检测成分影响的现象，可能是因为电喷雾离子化效率易受样品基质或色谱分离中的共流出物影响了待测成分的离子化效率，从而导致目标物响应信号的改变，产生基质增强或基质抑制效应[13]。用乙腈试剂和不同空白草莓基质溶液配制相同浓度的农药溶液，采用色谱进样来获得目标物的定量离子色谱峰面积，以试剂标的峰面积为标准来计算基质标中农药基质效应的相对强度，结果(图5)。4种农药在不同草莓样品间的微乳剂值在0.98～1.12，基质效应略微增强，不同草莓空白基质间的差异很小，可忽略不计。为使定量结果更准确，采用了反相高效液相色谱法洗脱分离目标化合物，减少共流出物，降低了基质干扰，同时采用基质匹配标准溶液校正方法对基质效应进行补偿。

图5 4种农药在草莓基质中的微乳剂

2.5 方法的线性范围和检出限 用空白草莓基质溶液配制4种农药的混合标准溶液，以每种农药的质量浓度(x， mg/L)为横坐标，定量离子对的色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，详细结果(表3)，线性相关系数r均>0.998 6。用Masslynx V4.1软件计算信噪比(S/N)，并以S/N=3计算得到了方法的检出限为1.2～2.0μg/kg。

表3 4种农药的基质匹配标准曲线、线性相关系数及检出限

2.6 方法的回收率、精密度与定量限 以空白草莓样品为基质，添加0.010、0.050、0.10mg/kg 3个浓度水平混标，每个添加水平重复测定 6次，做样品加标回收率试验。为模拟实样检测过程，称样后加入4种农药混标，涡旋1min，密封过夜，待样品充分吸收农药后，次日按照1.3～1.6节方法进行样品前处理及上机检测，数据结果(表4)。4种农药的定量限均为0.010mg/kg，平均添加回收率为85.2%～108.2%，相对标准偏差(RSD)为2.8%～5.9%，回收率和精密度符合农药残留检测的要求[14]。

表4 草莓样品添加回收率和精密度(n=6)

续表

2.7 实样检测 按本方法对40个草莓样品进行检测分析，每个样品做平行双样，发现目标农药的检出率仅为5%，共有2批草莓中检出含有目标农药，分别为阿维菌素和噻嗪酮，但都没有超过国内外最大允许残留限量值[15]。

3 结论

建立了QuEChERS 前处理方法结合 UPLC-MS/MS 检测草莓中噻螨酮、唑螨酯、噻嗪酮、阿维菌素等4种农药残留的方法。采用基质匹配标准溶液外标法定量，前处理过程简便快速、稳定性好、灵敏度高，回收率和精密度等指标均符合农药残留检测的要求，适用于草莓中该4种农药的同时快速测定。