以平菇菌渣为主复合基质栽培铁皮石斛的试验研究
2022-07-06谭善财谭长金邬小兰
谭善财 谭长金 邬小兰
摘要 [目的]研究平菇菌渣復合基质对铁皮石斛生长特性和多糖含量的影响。[方法]高效液相色谱法检测以棉籽壳为主原料平菇菌渣中棉酚，测定菌渣复合基质孔隙度和蒸发速率，比较不同基质对铁皮石斛株高、鲜重、干重、干鲜比和多糖含量的影响。[结果]菌渣复合基质未检测出棉酚有毒成分，基质大小孔隙比从大到小依次为JZ（菌渣）
关键词 平菇菌渣;复合基质;大小孔隙比;铁皮石斛;多糖
中图分类号 S 567.23+9 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2022）12-0149-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.038
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Experimental Study on Cultivation of Dendrobium officinale with P.ostreatus Residue as Main Composite Substrate
TAN Shan-cai1，2，TAN Chang-jin3，WU Xiao-lan1
（1.Tongren Polytechnic College，Tongren，Guizhou 554300;2.Key Open Laboratory of Traditional Chinese Veterinnary Medicine，Tongren，Guizhou 554300;3.Xinjiang Medical University，Urumqi，Xinjiang 830000）
Abstract [Objective]To study the effects of compound substrate mainly made up by P.ostreatus residue on growth characteristics and polysaccharide content of Dendrobium officinale.[Method] The content of the gossypol of P.ostreatus residue mainly made up by cottonseed hull was determinated by HPLC.The porosity and evaporation rate of the bacterial residue composite matrix were determined，and the effects of different matrices on the plant height，fresh weight，dry weight，dry-fresh ratio and polysaccharide content of Dendrobium officinale were compared.[Result]No toxic components of gossypol in P.ostreatus residue were detected.The matrix size void ratio from large to small was JZ（P.ostreatus residue）< 1（P.ostreatus residue∶pine bark∶gravel = 8∶1∶1，V/V/V）
Key words P.ostreatus residues;Compound substrate;Void ratio;Dendrobium officinale;Polysaccharide
铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科石斛兰属多年生草本植物，适宜在凉爽、湿润、通气、利水、半阴半阳的环境生长，通常生长于海拔达1 000 m以上的山地岩石、树皮粗糙长有苔藓树木及林下腐殖土中[1]。林下中药材种植是充分利用土地资源发展仿野生种植、生态种植的有效策略[2]。贵州省大力发展林下经济，实施铁皮石斛、黄精、天麻等中药材林下规模化种植，规划2025年种植规模达16.67万hm2[3]。
我国食用菌产业快速发展，成为世界上食用菌第一生产大国，每年至少产生1 000万t菌渣[4]。食用菌产业为贵州省一项支柱产业和农业特色优势产业，2021年食用菌规模突破5亿棒，产量突破160万t，产生上百万吨菌渣[5]。菌渣是由棉籽壳、麦麸、玉米芯、稻草秸、木屑等原料栽培食用菌后废弃的固体物质，含丰富的粗蛋白、粗纤维、氨基酸以及氮、磷、钾等元素，广泛应用于有机肥料、菌糠饲料、二次种菌栽培料、生态修复材料、燃料、养殖垫料等[6]。
食用菌菌渣疏松，总孔隙和持水孔隙大，蒸发慢，相对松树皮、碎石，保水性较强[7-10]。栽培铁皮石斛基质的主要原料为松鳞、木屑和碎石，通气及利水较好，但保水性差。规模化的栽培需要大量的松鳞，必然造成人为地破坏植被，浪费植物资源，影响生态环境。该研究以栽培平菇的菌渣为原料，添加一定量松鳞和碎石栽培铁皮石斛，旨在大规模的林下栽培铁皮石斛中高效利用菌渣资源，寻找一种高效保湿利水透气的种植基质，提高菌渣利用度、拓展其综合利用途径。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试材。
铁皮石斛幼苗（1年生）和松鳞（3～4 cm）购买于贵州健神农业科技发展有限公司;平菇菌渣和碎石（2～3 cm）由铜仁市梵净山食用菌菌种繁育工程技术研究中心提供，菌渣由棉籽壳、麦麸、木屑（7∶2∶1）的原料栽培平菇后废弃固体物质。
1.1.2 试剂。棉酚对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号B20869，纯度≥97% ）;D-葡萄糖对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号Y19F11J108781，纯度 ≥ 98% ）;乙腈（色谱纯，Tedia Company，Inc.）;苯酚、硫酸、甲醇、乙醇，化学纯，贵州铜仁市科仪化玻站;超纯水自制。
1.1.3 仪器。
Agilent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）;色谱柱Eclipse Plus C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）;LDZF-75L-I立体式高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）;T-10紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）;CPA225D电子天平（赛多利斯斯泰迪有限公司）;TDZ5-WS低速离心机（东旺化玻仪器有限公司）;超纯水仪New Human Power Ⅰ （Human Corporation）。
1.2 试验方法
1.2.1 菌渣中棉酚的提取与测定。
平菇菌渣中主要成分是棉籽壳，棉籽中含有游离棉酚，对生物心脏、肝脏、生殖系统和免疫等具有一定的危害[11-12]。棉籽壳或棉籽粕中可能具有一定的棉酚，因此利用菌渣复合基质栽培铁皮石斛前，利用高效液相色谱检测确定其是否含有棉酚。
1.2.1.1 棉酚对照品溶液的配制。精密称取棉酚对照品5.104 mg于25 mL容量瓶，甲醇溶解，定容至刻度，得0.204 mg/mL 棉酚对照品溶液。
1.2.1.2 样品溶液的制备。精密称取5.001 g菌渣3份，分别置于250 mL具塞锥形瓶中，按料液比1∶15加入70%丙酮，在40 ℃下超声提取2次，每次50 min（功率250 W，频率50 Hz）[13]，合并滤液，50 ℃下旋干，甲醇溶解，转入10 mL容量瓶，定容至刻度，冷藏，待测。
1.2.1.3 色谱条件。色谱柱Eclipse Plus C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液（85∶15），流速1.0 mL/min，检测波长235 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL[14]。
1.2.2 以菌渣为主复合基质孔隙度的测定。试验设计5组：菌渣组（JZ）;松鳞组（SL）;试验组中各组分按体积配比，菌渣∶松鳞∶碎石（8∶1∶1，E1）、菌渣∶松鳞∶碎石（6∶2∶2，E2）、菌渣∶松鳞∶碎石（4∶3∶3，E3）。
基质总孔隙度、通气孔隙度、持水孔隙度采用环刀法测定[15]。将环刀底部用不带孔的底盖扣紧，装满基质，然后扣上带孔的顶盖，称重（m1），填装基质紧实度接近栽培铁皮石斛基质紧实度;带孔的顶盖居上，将环刀浸泡在水中24 h后，取出环刀，用吸水纸吸干其表面的水，称重（m2），将环刀带孔的顶盖朝下，倒置在铺有滤纸的漏斗上，静置至沒有水渗出为止，称环刀、基质及其中持有水的重（m3）。重复3次。基质总孔隙度、通气孔隙度和持水孔隙度分别按以下公式计算：
TP=m2-m1V×100%（1）
AP=m2-m3V×100%（2）
WP=（TP-AP）×100%（3）
式中，TP为基质总孔隙度（%）;m1为环刀和基质质量（g）;m2为充分吸水后，环刀、基质和水的质量（g）;V为环刀的容积（cm3）;AP为基质通气孔隙度（%）;m3为环刀倒置排水后，环刀、基质及其中持有水的质量（g）;WP为基质持水孔隙度（%）。
1.2.3 以菌渣为主复合基质蒸发速率的测定。
基质最大持水量的测定方法参考李志刚等[15]报道的环刀法，略有改动。将高11 cm、外口径16.5 cm 花盆底部内表面（有3个大小相等的圆形小孔）盖上3层医用纱布，分别装入等体积高度为10 cm的基质（JZ、SL、E1、E2、E3），紧实度与栽培铁皮石斛的基质接近，称重m1;用托盘盖住花盆上端，在托盘上表面加石头，托盘与基质上表面相距1 cm，将花盆2/3体积浸在水中24 h后，取出静置，花盆底部没有水流出时，去掉石头和托盘，称重（m2）;放入人工大棚中，使其自然蒸发，每隔1 d称重1次，连续测5次。分别计算各基质的含水率，用每天基质失水率代表蒸发速率，重复3次。2019年8月测各基质蒸发速率，每隔1 d测1次，每次13：00测，温度平均（37.8±0.56）℃。基质蒸发速率（v）按以下公式计算：FE6BD4D9-2104-4C2D-8DAD-1025C6B00BC8
v=m3m2-m1×100%（4）
式中，v为基质蒸发速率（%）;m1为浸水之前花盆和基质质量（g）;m2为浸水之后花盆和基质质量（g）;m3为每隔1 d基质水蒸发量（g）。
1.2.4 不同栽培基质的铁皮石斛高度和质量的测定。将5种基质分别装入花盆中，基质高度为9 cm，将重量和高度无显著差异的一年生铁皮石斛苗种入花盆中，深度约为3 cm，每盆一丛3株，保留5根须根，置于人工大棚，每组试验各3盆。当年10月—次年4月，每隔4 d洒水一次;5—9月，每隔3 d洒水一次。幼苗于2020年4月17日在铜仁职业技术学院大棚种植，2022年2月17日测定每株铁皮石斛的地上部分高度，剪下地上部分植株，称重。
1.2.5 不同栽培基质的铁皮石斛样品多糖的测定[16]。
每组每丛剪下地上部分植株，在50 ℃下干燥，粉碎，粉末过40目药筛，精密称取粉末0.3 g，置于500 mL圆底烧瓶，加入水200 mL，热回流提取2 h，放冷至常温，转移至250 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL于离心管中，按1∶5（V/V）加入无水乙醇，摇匀，4 ℃下冷藏1 h后，离心20 min（4 000 r/min），除去无水乙醇，在鼓风干燥箱挥干沉淀，加50 ℃热水溶解，冷却后定容至25 mL，冷藏备用。
分别精密量取95 μg/mL葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL具塞试管，加水补足1 mL， 以苯酚-硫酸法测定不同浓度对照品溶液的吸光度，建立标准曲线，测定不同基质栽培铁皮石斛植株多糖含量。
1.3 数据处理
每组试验重复3次，利用软件 SPSS 23.0对不同基质栽培的铁皮石斛高度、重量、多糖含量的数据进行组间差异性分析。
2 结果与分析
2.1 菌渣中棉酚的含量 基于“1.2.1.3” HPLC色谱条件，对比棉酚对照品和菌渣样品溶液色谱峰的保留时间，在该试验条件及仪器的检测范围下，未检测出菌渣样品溶液含棉酚化学成分（图1）。可见，以棉籽壳为主要原料的平菇菌渣应用于铁皮石斛栽培，基质中未含棉酚有毒物质。
2.2 不同栽培基质的孔隙度 从表1可以看出，不同栽培基质总孔隙度从大到小依次为JZ > E1 > SL> E2 > E3，通气孔隙度从大到小依次为SL > E3 > E2 > E1 > JZ，持水孔隙度从大到小依次为JZ > E1 > E2 > E3 > SL。可见，平菇菌渣总孔隙度和持水孔隙度（小空隙）最多，通气孔隙度（大孔隙）最少;松鳞通气孔隙度最多，持水孔隙度最少，说明平菇菌渣小空隙多，持水量大;松鳞大孔隙多，通气性能最好，渗透性强。在试验组E1、E2、E3复合基质中，利用平菇菌渣持水量大、松鳞通气性能好和渗透性强，将菌渣、松鳞和碎石按不同体积比混合，寻找适合铁皮石斛栽培的保湿通气利水的复合基质。
大孔隙是指基质中空气占据的空间，即通气孔隙;小孔隙是指基质中水分所能占据的空间，即持水孔隙，又称为毛细孔隙度，这些孔隙会利用毛细管作用将水分吸持在基质中。通气孔隙度与持水孔隙度的比值称为大小孔隙比，它能够反映出基质中水、气之间的状况[17]。从表1可以看出，不同栽培基质大小孔隙比从小到大依次为JZ 2.3 不同栽培基质的蒸发速率 从图2可以看出，不同栽培基质蒸发速率从小到大依次为JZ < E1< E2 < E3 < SL，表现出与基质持水孔隙度（小空隙）呈负向的关系，即基质持水孔隙度越多，蒸发速率越慢。以JZ（菌渣）、SL（松鳞）、E1（V菌渣∶V松鳞∶V碎石 =8∶1∶1）、E2（V菌渣∶V松鳞∶V碎石=6∶2∶2）和E3（V菌渣∶V松鳞∶V碎石=4∶3∶3）为栽培基质，在第4～6天基质蒸发率分别为28.21% ～ 41.38%、44.11% ～ 62.33%、29.59% ～ 45.17%、30.59% ～ 47.74%和36.89% ～ 50.11%。孔德栋等[18]报道了光照较强和栽培基质含水量70%、光照较弱和栽培基质含水量40%时，植株生长较好，可溶性糖含量较高。可见，光照强度和基质含水量的交互作用对铁皮石斛的生长和含糖量有显著的影响，在光照较强、温度较高时，要保持基质充足的含水量。根据不同的基质蒸发率不同，保湿时间不同，有效保湿时间JZ>E1>E2>E3>SL;在该试验平均温度较高的环境中，JZ、E1、E2可以3 ～ 4 d噴灌1次，E3可以2～3 d 喷灌1次，SL（松鳞）1 ～ 2 d喷灌1次，能够满足铁皮石斛生长对水分的需求。 2.4 葡萄糖对照品标准曲线的绘制 根据苯酚-硫酸法测定多糖，以葡萄糖对照品质量浓度x（μg/mL）为横坐标、不同浓度对应的紫外吸光度y为纵坐标绘制标准曲线（图3），得出标准曲线方程为y=0.055 8x+0.139 7（R2 = 0.999 5），表明葡萄糖对照品浓度在2.71～13.57 μg/mL线性关系良好。 2.5 不同栽培基质对铁皮石斛株生长特性和多糖含量的影响 从表2可以看出，不同栽培基质对铁皮石斛株高、鲜重、干重、干鲜比和多糖含量有较大的影响。株高从高到低依次为E2 > E3 > JZ > E1 > SL，与E1、JZ组分别比较，E2、E3和SL组株高表现显著差异（P<0.05），E1与JZ组差异不显著（P>0.05）;干鲜比从小到大依次为E2 水分和空气是影响铁皮石斛生长和物质代谢的重要环境因子。不同的栽培基质大小孔隙比不同，直接影响铁皮石斛对水分和空气的吸收。由菌渣、松鳞和碎石组成的复合基质E2、E3，在株高、鲜重、干重、干鲜比和多糖含量方面较E1、SL和JZ基质有明显的优势，这与复合基质相应的大小孔隙比容纳适宜的水分和空气状况相关。 3 结论 棉籽壳及棉粕经过物理或化学或生物的方法处理后，降解棉酚降低其毒性，才能再次利用。利用高效液相色谱法检测以棉籽壳为主要原料平菇菌渣中棉酚，未检测出菌渣样品溶液含棉酚化学成分，因此，该平菇菌渣可应用于铁皮石斛的栽培。 大小孔隙比（通气孔隙度/持水孔隙度）反映了栽培基质的通气状况和持水量，影响植物的长势和有效成分的含量。该研究以JZ（平菇菌渣）、SL（松鳞）、E1（V菌渣∶V松鳞∶V碎石 = 8∶1∶1）、E2（V菌渣∶V松鳞∶V碎石 = 6∶2∶2）和E3（V菌渣∶V松鳞∶V碎石 = 4∶3∶3）为铁皮石斛栽培基质，大小空隙比分别为1∶1.8、1∶0.6、1∶1.5、1∶1.1和1∶0.8，复合基质E2、E3在株高、鲜重、干重、干鲜比和多糖含量方面较E1、SL和JZ基质有明显的优势。可见，铁皮石斛株生长特性和多糖含量与栽培基质大小孔隙比有一定的相关性，大小孔隙比在1∶0.8～1∶1.1，长势好，多糖含量高;随着持水量的增加，即大小孔隙比在1∶1.5～1∶1.8，铁皮石斛干重、干鲜比和多糖含量不断下降;松鳞大小孔隙比为1∶0.6，即持水孔隙度小，持水量低，也影响铁皮石斛干重、干鲜比和多糖含量。 平菇菌渣、松鳞和复合基质的蒸发速率为灌溉的间隔时间提供了参考。在温度较高时， JZ、E1、E2可以3 ～ 4 d喷灌1次， E3可以2～3 d喷灌1次，SL可以1 ～ 2 d喷灌1次，能够满足铁皮石斛生长对水分的需求。该结果为大规模的林下或大棚人工栽培铁皮石斛高效利用菌渣资源提供参考。 参考文献 [1] 谭善财，梁玉勇，文晓棠，等.一种石斛仿野生保湿抗风的种植装置：CN202020650174.3[P].2020-12-08. [2] 王红阳，康传志，张文晋，等.中药生态农业发展的土地利用策略[J].中国中药杂志，2020，45（9）：1990-1995. [3] 方碧陶.贵州省规划2025年林下中药材种植规模达450万亩[J].中医药管理杂志，2021，29（22）：180. [4] 张淑琴.食用菌菌渣配制生物有机肥在园林绿化中的应用[J].中国食用菌，2020，39（11）：196-199. [5] 刘久锋.黔菌出山 异军突起[N].农民日报，2021-08-12（001）. [6] 郑玉权，李尚民，范建华，等.食用菌菌渣资源化利用研究进展[J].安徽农学通报，2019，25（12）：39-40，146. [7] 韩建东，宫志远，万鲁长，等.一种食用菌菌渣综合利用的方法：CN201610111819.4[P].2019-03-08. [8] 时连辉，张志国，刘登民，等.菇渣和泥炭基质理化特性比较及其调节[J].農业工程学报，2008，24（4）：199-203. [9] 吕晓惠，杨宁，李海燕，等.菌渣部分替代草炭对樱桃番茄生长及养分吸收的影响研究[J].中国农学通报，2016，32（4）：63-67. [10] 金静，郑奕，刘士辉，等.食用菌菌渣在黄瓜无土栽培中的应用研究[J].安徽农业科学，2014，42（24）：8121-8122. [11] MORGAN S，STAIR E L，MARTIN T，et al.Clinical，clinicopathologic，pathologic，and toxicologic alterations associated with gossypol toxicosis in feeder lambs[J].American journal of veterinary research，1988，49（4）：493-499. [12] 赵大伟，劳泰财，叶强，等.棉酚的特性与棉籽粕脱毒方法的研究进展[J].广东饲料，2015，24（6）：37-40. [13] 柴秀航，付元元，毕艳兰，等.棉仁中游离棉酚提取工艺的优化[J].中国油脂，2014，39（5）：61-65. [14] 袁洁，李洋，姚军.高效液相色谱法测定新疆彩棉中游离棉酚含量[J].化学与生物工程，2020，37（9）：66-68. [15] 李志刚，刘晓刚，李健.硫酸铵与鸡粪配比在含生物质炭育苗基质中的应用效果[J].中国土壤与肥料，2012（1）：83-88. [16] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2020年版 一部[S].北京： 中国医药科技出版社，2020：295-296. [17] 李斗争.组成成分及颗粒粒径对基质孔隙特性的影响研究[D].泰安：山东农业大学，2006. [18] 孔德栋，钟远香，沈宏亮.水分与光照互作对铁皮石斛生长、光合特性及可溶性糖含量的影响[J].华中农业大学学报，2015，34（5）：19-24.FE6BD4D9-2104-4C2D-8DAD-1025C6B00BC8
