阿加曲班联合声动力疗法抗C6胶质瘤细胞作用的相关研究

詹奇，杨欣

1.哈尔滨医科大学附属第四医院神经外三科，黑龙江哈尔滨 150000；2.哈尔滨医科大学附属第一医院干部一病房，黑龙江哈尔滨 150000

颅内最常见的肿瘤之一为脑胶质瘤，目前研究未发现其彻底根治的疗法，故此治疗胶质瘤、提升生存率已成为神经外科领域中的诊疗难点。目前外科手术只能尽力全部切除，辅助放疗和化疗等方法的疗效仍不理想，患者往往在术后一段时间复发，难以根治。声动力疗法（SDT）原理为超声能够激活光敏剂中的某些卟啉类增敏剂效应，从而杀伤肿瘤细胞，其组织穿透性更深[1-2]。SDT疗法在体外和体内同时具有抑制胶质瘤生长的作用。凝血酶受体（PAR）-1可促进内皮细胞和肿瘤细胞生长增殖，使肿瘤细胞的致瘤性增强；同时，PAR-1能增加体外肿瘤细胞和肿瘤微环境中各种成分的粘附性，使细胞在体内的转移过程加快，从而诱导血管生长因子的合成及分泌，被认为是一种潜在的促血管生长因子，与肿瘤的发生、发展有着密切的关系[3-4]。阿加曲班是一种新型凝血酶抑制剂药物，它能够可逆地、高选择性地和凝血酶活性相应位点结合，以此来阻断由凝血酶催化的一系列复杂凝血过程，抑制血凝块中的凝血酶活性[5-6]。该研究于2020年7月—2021年7月探讨应用阿加曲班联合声动力治疗C6胶质瘤细胞的效果，结果可见二者联合治疗可提高抑瘤率，为临床阿加曲班联合声动力疗法治疗脑胶质瘤奠定坚实的基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

细胞系：C6 胶质瘤细胞系。主要试剂：DMEM，10% 新生小牛血清，0.25% 胰酶，血卟啉甲醚（HMME），阿加曲班，兔抗鼠PAR-1抗体。

1.2 方法

1.2.1 C6胶质瘤细胞培养选取10%胎牛血清的完全培养液，将C6 胶质瘤细胞接种于培养瓶中，放入37℃、5%CO2的常规细胞培养箱中，常规2～3 d换液，待细胞处于对数生长期时收集细胞，将其进行实验分组。随机分为4组，A组：空白对照组，不给予药物治疗。B 组：声动力（SDT）组。C 组：阿加曲班组。D组：声动力+阿加曲班组。

1.2.2 Real-time PCR 检测 用三唑溶液（Invitrogen）分离细胞RNA。然后，利用PrimeScriptTM RTMaster Mix 将RNA 反 向 转 录 成cDNA。RT-qPCR 是 与SYBR 预混料Ex-Taq-Ⅱ在480 仪器上实施。采用比较Ct法检测基因表达。

1.2.3 Western blot 检测Wnt 蛋白表达，培养每组5×106个细胞，裂解细胞，25 μg 蛋白样品；依次经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳、转膜、封闭等步骤；通过增强化学发光法(ECL)检测蛋白表达，用Image-Pro Plus 6.0 软件分析各蛋白条带相对吸光度，并作定量计算。选用B-actin为内参对照组。

1.2.4 MTT 法检测收集对数生长期C6 胶质瘤细胞，接种于96 孔板，每孔100 μl，每孔为8×103个细胞，每组设计5个复孔。加入氯化钴、不同浓度VEGF抗体药液处理24 h 后，每孔加入检测溶液（5 mg/mL）20 μl，37℃孵育4 h，弃去孔内培养基，每孔再加入200 μl 二甲基亚砜，作用10 min。以空白孔调零，酶联免疫检测仪检测490 nm波长处吸光度，重复3次，计算各组数据均值。以对照组细胞活性为100%，处理组吸光度值与对照组比值×100%即为实验各组细胞活性。

1.2.5 FCM 法检测C6 胶质瘤细胞贴壁生长，经胰酶消化、放入离心机离心，培养液悬浮，制成单细胞悬液5 mL，放入直径1.0 cm 的10 mL 玻璃试管中，分组SDT 处理。4 组细胞继续避光培养6 h，离心弃上清收集细胞，PBS 溶液洗涤2 次，75%酒精固定，制备5×106的单细胞悬浮液1 mL，4℃放置24 h，用流式细胞仪检测4组肿瘤细胞的凋亡率情况。

1.3 统计方法

采用SPSS 19.0 统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料用（±s）表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Real-time PCR 检测结果

声动力疗法治疗后通过Real-time PCR 检测PAR-1 表达情况，结果显示声动力疗法治疗后，C6胶质瘤细胞中PAR-1 表达较治疗前显著升高，见图1。声动力组治疗后PAR-1 表达水平为（7.844±0.288），与对照组（4.844±0.184）比较，差异有统计学意义(t=3.416，P＜0.05)。

图1 声动力治疗前后Real-time PCR 检测C6胶质瘤细胞中PAR-1的mRNA表达情况

2.2 Western blot检测结果

声动力疗法治疗后通过Western blot 检测PAR-1表达情况，结果显示声动力疗法治疗后，C6胶质瘤细胞中PAR-1 表达较治疗前显著升高，见图2。声动力组治疗后PAR-1 表达为（9.874±0.273），与对照组（4.746±0.167）比较，差异有统计学意义(t=3.511，P＜0.05)。

图2 声动力治疗前后Western blot检测C6胶质瘤细胞中PAR-1的蛋白表达情况

2.3 MTT法检测结果

SDT+阿加曲班组与其他3 组比较，抑瘤率显著升高；阿加曲班组、SDT 组抑瘤率较对照组高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

2.4 FCM检查结果

SDT+阿加曲班组与其他3 组比较，凋亡率显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；阿加曲班组、SDT组凋亡率较对照组高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 4组MTT法检测FCM检查抑瘤率、凋亡率比较[(±s),%]

表1 4组MTT法检测FCM检查抑瘤率、凋亡率比较[(±s),%]

组别SDT+阿加曲班组阿加曲班组SDT组对照组抑瘤率62.36±11.34 15.76±10.12 14.36±9.24 0.01±7.12凋亡率39.36±4.56 12.36±5.23 11.56±4.12 1.36±0.12

3 讨论

声动力疗法（SDT）是目前研究发现的一种新的肿瘤治疗方法，它来源于光动力疗法，是1989年由Umemura等在研究超声诊断和血卟啉的协同效应而发展成的。大量实验证明SDT在体内及体外具有抑制胶质瘤生长的作用，由于SDT 相比PDT 有更深的组织穿透性，超声亦能激活原为光敏剂的某些卟啉类增敏剂而杀伤肿瘤细胞[7-9]。超声能够穿透深部组织而激活增敏剂；光、声动力联合治疗其原理为激活共同的增敏剂，产生更多的毒性物质，从而增强杀伤肿瘤细胞的效果。

Billroth 于1878年在实验研究证实的基础上提出观点为在肿瘤转移和凝血机制之间存在某种联系的假说理念，使广大学者对凝血系统和肿瘤的关系进行了深入广泛的研究[10]。相关研究证实了凝血酶存在于多种类型的肿瘤细胞中，从而解释了在肿瘤患者中出现的高凝现象，但并不能完全解释凝血酶与肿瘤发生、发展存在直接、密切的关联[11-13]。有研究证实，凝血酶能促进肿瘤的生长转移功能，因为凝血酶本身具有促进肿瘤血管生长的能力，其促血管生成作用在鸡胚尿囊膜实验中已被证实，同时发现此研究效应是通过特殊凝血酶受体PAR-1 介导协同完成的，与纤维素的形成无关联[14]。凝血酶在肿瘤的血管形成发展中起到了重要的作用，是肿瘤生长转移的必要条件。凝血酶可促进肿瘤细胞和内皮细胞的生长增殖，肿瘤细胞的致瘤性增强，能增加肿瘤微环境中各种成分的粘附聚集，细胞在体内的转移过程不断加快，从而诱导血管生长因子的分泌合成，其被认为是一种潜在的促血管生长因子，与肿瘤的发生、发展有密切的关系。

阿加曲班是一种新型的凝血酶抑制剂药物，它能够可逆地、高选择地与凝血酶活性相关位点相结合，中断凝血酶催化的一系列凝血过程。临床应用于脑血栓、脑梗塞、静脉窦血栓治疗中，并取得良好效果。以往的研究中，阿加曲班可抑制PAR-1 表达水平，MTT 法检测阿加曲班组的抑瘤率为（14.25±9.36）%，与其他组对比，差异有统计学意义(P＜0.05)，与该研究结果相吻合；该研究中，MTT 法检测SDT+阿加曲班组的抑瘤率为（62.36±11.34）%，与其他三组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；阿加曲班组的抑瘤率（15.76±10.12）%较对照组抑瘤率高，但较SDT+阿加曲班组抑瘤率低(P＜0.05)；SDT 组（14.36±9.24）%较对照组（0.01±7.12）%高，但较SDT+阿加曲班组低(P＜0.05)。有学者用胶原酶Ⅳ诱导大鼠脑出血模型，研究结果可见，应用阿加曲班72 h能显著减轻脑水肿，血肿未见扩大；应用阿加曲班24 h能抑制多形核白细胞的渗出，抑制单核-巨噬细胞的活性。故此，阿加曲班能减轻脑出血后伴发脑水肿在内的继发性脑损伤病例[15-16]。Huang J 等[15]研究指出，凝血酶通过诱导脑水肿发展形成、增殖细胞和生成血管的作用，引发胶质瘤患者不良的预后反应。而应用阿加曲班治疗，通过抗凝血酶能够减轻脑水肿发展程度，减慢胶质瘤的生长速度，从而改善肿瘤导致的神经性功能障碍情况[16-18]。该文中，Real-time PCR 检测显示，声动力组治疗后PAR-1 表达水平为（7.844±0.288），与对照组（4.844±0.184）比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；Western blot 检测显示，声动力组治疗后PAR-1 表达为（9.874±0.273），与对照组（4.746±0.167）比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。SDT+阿加曲班组与其他3组比较，凋亡率显著升高；阿加曲班组、SDT组抑瘤率较对照组高(P＜0.05)。

综上所述，应用阿加曲班联合声动力治疗C6胶质瘤细胞，可以提高抑瘤率，为临床应用阿加曲班联合声动力治疗脑胶质瘤的研究奠定了实验基础。