农药对鸟类的高级阶段风险评估方法

周艳明，袁善奎，单炜力

(农业农村部农药检定所，北京 100125)

农药对鸟类的潜在影响早已引起人们的关注。欧盟于2002年发布了农药对鸟类和哺乳动物风险评估的导则[1]，规定了农药对鸟类和哺乳动物的风险评估方法，并于2009年修订[2]。美国环保署(Environmental Protection Agency，EPA)于1998年发布了《生态风险评估导则》[3]，概述了农药生态风险评估的原理，但未提供具体的评估方法。美国EPA下设的农药项目办公室(Office of Pesticide Program)2004年发布的《生态风险评估过程概述》[4]中给出了对陆生动物(鸟类和哺乳动物)的评估方法。

我国目前已建立农药对鸟类的风险评估方法[5]，但该标准中仅规定了高级阶段评估可考虑的部分因素，未详细描述具体的试验和评估方法。根据《农药登记资料要求》[6]，申请农药登记时需提供对鸟类的急性、短期和繁殖毒性试验报告以及对鸟类的风险评估报告。当初级阶段风险评估表明对鸟类的风险不可接受时，可进行高级阶段试验与评估。本文综述了农药对鸟类的高级阶段风险评估方法，当初级阶段风险评估表明风险不可接受时，可从以下方法中选择1种或多种方法开展高级阶段风险评估。

1 测定鸟类食物中的农药残留量

在初级评估中使用农药的施药剂量和单位剂量残留量估算鸟类食物中农药的残留量，在高级评估中，可使用农药在鸟类食物(植物、昆虫等)的实测残留量。如果指示物种以摄食植物为主，可考虑使用农药登记残留资料中的数据。残留资料中可能有初始残留量及残留物消解动态方面的信息，但需注意残留试验中检测的植物部分与指示物种的食物是否相符。如果指示物种以摄食昆虫为主，可开展试验测定昆虫的农药残留水平。收集昆虫的方法包括用网捕捉、用棍子敲打树木并收集掉落的昆虫或设置陷阱等，根据初级评估结果及鸟类可能摄入的昆虫类型确定。收集的昆虫应是鸟类可能摄入的昆虫。用不同方法采集的样品需分别保存并检测。

如果试验中农药按标签中的使用方法多次使用，并在最后一次使用后采样，则暴露评估中不使用多次施药因子。在急性评估中取初始残留量的第90百分位，短期评估中取初始残留量的算数平均值，长期评估中取时间加权平均残留量。

在设计试验时，应考虑以下因素：

(1)施药方法应符合最糟糕情况下的良好农业规范(GAP)。

(2)试验地点和条件应有代表性，通常需在多地点进行试验。

(3)应根据初级评估结果确定采样时间和采样次数。例如，初级风险评估表明对鸟类存在较高的急性风险，则应在施药后立即采样；初级风险评估表明对鸟类存在短期或长期风险，则试验中采样时间点的数量应能确定被试物在鸟类食物中的半衰期。

2 优化多次施药因子和时间加权平均因子

在初级评估中，使用默认的半衰期10 d计算多次施药因子(MAF)和时间加权平均因子(ftwa)，高级阶段评估时，可使用消解半衰期数据优化MAF和ftwa。

Willis和McDowell[7]综述了81种有效成分在多种植物上的450个半衰期，总残留物的半衰期平均值和标准偏差为：有机氯农药，5.8±6.0d；有机磷农药，3.3±2.6d；氨基甲酸酯类农药，2.7±1.2d；拟除虫菊酯类农药，5.9±5.0d。可使用残留资料中施药后最初几周的消解动态数据计算农药的半衰期。

对于昆虫，迁移和繁殖引起的个体替代将导致种群中残留物的减少，多次施用对栖息在叶片的昆虫中不会出现明显累积，因此计算昆虫中残留量时可不使用MAF[1]。

在初级评估中基于3周时间、半衰期=10d计算ftwa。欧盟2002年指南[1]中注明，“没有合理的科学依据也没有普遍接受的规则来规定求平均值的时间段应多长。大多数专家不同意简单的使用试验时间。除非有充分的理由缩短或延长，否则目前将求平均值的时间段定为3周。”。鸟类繁殖毒性试验中给药周期至少为20周，通常为22周，可使用鸟类繁殖毒性试验周期优化ftwa。但应注意以下几点：

(1)已采取其他优化措施时，不宜再以试验周期优化ftwa；

(2)在鸟类繁殖毒性试验中，暴露后很短时间即观察到效应，或效应可归因于敏感期的短时间暴露时，则应以该时间计算ftwa；

(3)有效成分在环境中具有持久性时，不宜以试验周期优化ftwa；

(4)有效成分对鸟类具有内分泌干扰作用时，不宜以试验周期优化ftwa。

3 研究鸟类的回避行为

鸟类的回避行为可显著降低农药的暴露。鸟类的回避行为可能由驱鸟剂或可引发厌食的有效成分导致，这种情况下在鸟类饲喂毒性试验中可观察到拒食现象。对于颗粒剂和种子处理剂，因助剂、颜色、形状、质地等因素，也能观察到鸟类的回避行为。

鸟类毒性试验中测定饲料消耗量的可用于估算回避因子(AV)。例如，处理组的饲料消耗量是正常消耗量的10%，则AV=0.1，并可将其用于暴露量的计算。但有机磷、氨基甲酸酯等农药在试验开始时回避行为不明显，在达到某个阈值剂量后才出现显著的回避行为[2]，在此情况下在暴露评估中不能简单的使用AV计算暴露量。

可通过试验明确鸟类的回避行为。回避的程度以及规避风险的有效性与多种因素有关，而这些因素在实验室和田间可能有所不同，因此目前尚无国际通行的试验准则，但经济合作与发展组织(OECD)1996年的鸟类毒性试验研讨会总结报告[8]中给出了研究鸟类回避行为的试验原理、筛查方法和试验方法的建议。开展试验时，应选择最能体现现实情况的设计，试验设计的主要因素包括：

——将农药混入基本食物作为被试物或者以颗粒剂、处理过的种子为被试物；

——试验区域的大小：鸟笼、小鸟舍、大鸟舍；

——受试鸟单笼饲养或者成组饲养；

——给药方式：杯子、托盘或撒在地面；

——是否提供替代食物；

——替代食物与被试物是否相似；

——暴露时间。

4 确定关键物种

关键物种是在使用农药时出现在作物种植区域的真实鸟类物种。使用关键物种的目的是在更接近实际情况的条件下开展风险评估。每种作物种植区域可能有多个关键鸟类物种。

4.1 试验地选择 选择的观测试验地和作物应与农药的使用区域和作物一致，并应在农药的典型使用时期开展试验。调查的田地至少应相隔250m，以避免重复计算。在报告中应说明试验地的种植情况及周围栖息地情况。将数据外推至其他地点或相近作物时，应证明其合理性。

4.2 调查方法 主要有两种调查方法：样线法(transect method)和样点法(point count method)。

4.2.1 样线法 在种植目标作物的农田确定1纵向基线，观察者沿基线步行，记录基线两侧一定距离(如两侧各50m)范围内的所有鸟类。

4.2.2 样点法 观察者在单一位置调查整片农田的鸟类，以避免惊扰鸟类。该方法更适合观测新耕的农田和裸土上的鸟类。

4.3 数据分析 以下信息与关键物种最相关：

4.3.1 农田观测频率(frequency of observation in the field,FOfield) 指不考虑观察到的个体数量如何，只记录特定物种出现的农田数量占总农田数量的百分比。该方法可用于衡量物种出现的空间频率，或物种所在的农田比例。一个物种的田间观测频率为100%表明在这次观测中，在所有的农田都观察到了该物种。

4.3.2 调查观测频率(frequency of observation per survey,FOsurvey) 指记录到特定物种出现的调查频次占总调查频次的百分比。该方法可近似的给出整个试验期间物种出现的时间均匀度。一个物种的调查观测频率为100%表明在每次调查时至少观测到了该物种。

4.4 选择关键物种 优先选择观测频率>20%的物种作为关键物种，但同时还应考虑食性、摄食量、体重等因素以确保能保护潜在暴露量最高的物种。农田观测频率或调查观测频率最高的物种并不一定就是关键物种。例如，燕子在某段时间在农田中普遍存在、数量较多，虽然其单位体重食物摄取量高、摄食小型无脊椎动物，但其主要摄食空中的无脊椎动物，其食物中农药的残留量低，不能外推到保护其他物种，不宜作为关键物种[2]。Dietzen[9]等欧盟农药鸟类风险评估中的关键物种，并给出了确定小麦田关键物种的示例。

5 优化PT和PD

PT为鸟类在施药区域获得食物的时间比例，PD为不同食物类型在鸟类饮食中的比例。在初级评估中，假定PT和PD均为1(即假定某种鸟类的食物数量及种类均来自于有农药暴露的农田食物)，但如果有足够的信息则可以优化PT和PD。不同的作物和鸟类物种会得出不同的PT和PD，在优化PT和PD时，通常将重点放在一种或两种关键物种上。

5.1 PT 在田间很难直接获得鸟类在施药区域摄食比例的数据，因此可以根据在施药区域中消耗的时间来估算PT。可以通过无线电跟踪的方式获得PT数据，捕捉野生鸟类并安装无线电发射器或GPS装置，并记录其在施药农田中的活动时间。无线电跟踪的同时进行人工观察，则可明确在施药农田中的觅食时间。

目前尚无国际公认的试验准则，但欧盟评估指南[2]的附录P中对该类试验有较详细的说明，试验计划可参考Crocker等[10]研究报告的附录1，将无线电发射器安装到小型鸟类尾羽上的方法可参考该报告的附录2。

5.1.1 无线电跟踪方法 使用无线电跟踪技术的目的一是定位鸟类个体，以便观察其行为；二是在一段时间内持续跟踪某一鸟类个体，以明确其在施药农田中活动的时间比例。

在每次观测过程中，应持续跟踪鸟类个体。鸟类行为和位置的变化记录应精确至分钟，应定时更换观测人员以保持观测人员注意力集中。试验中应观测鸟类在全天(从日出至日落)的活动，而不管鸟类的依从性如何，即不因鸟类离开而缩短观测时间、也不因鸟类易于观测而延长观测时间。

使用八木天线可以确定被跟踪鸟类的位置，无线电信号强度可估算与鸟类的距离。为尽量准确描述被跟踪鸟类的行为并验证其位置，当鸟类未被植被隐藏时，尽量目视或使用望远镜观察鸟类。可使用有颜色的脚环帮助识别鸟类个体。保持适当的安全距离以避免影响鸟类的行为。

鸟类的觅食行为与鸟类生殖周期不同阶段的营养需求、栖息地环境和食物供应等因素有关，PT也会因这些因素的改变而变化。因此应在登记作物的典型生长阶段以及具有代表性的栖息环境开展试验。通常至少应在给定场景中捕捉20只关键鸟类并观测其活动。

5.1.2 鸟类个体PT的计算 根据无线电跟踪试验观测结果，可将观测鸟类的行为分为“可能在觅食”与“不在觅食”两种情况(表1)。

表1 用于计算PT的鸟类行为类别

观测鸟类个体的PT=在目标作物的觅食时间/总觅食时间。鸟类个体PT的计算示例(表2)，假设无线电跟踪观测结果表明观测鸟类在目标作物的觅食时间为4h，则PT=4h/9h=0.44。

表2 鸟类个体PT计算的示例

5.1.3 风险评估所需PT的计算 通常无线电跟踪试验会跟踪观测20只鸟，因此可结算出20个观测鸟类个体的PT。欧盟评估指南[2]中并未规定在风险评估中应如何使用，只指出“如果用中位值或平均值代替默认的PT=1，则在没有其他安全系数的情况下，将表明风险评估仅对一半目标种群具有保护作用。风险管理人员需确定应保护的种群比例。”。目前欧盟成员国在评估中使用个体PT的第90百分位[11]，计算方法如下：

第一步：检查数据

①所跟踪的物种是关键物种；

②作物与GAP相关；

③季节与GAP相关；

④环境是农药将使用的典型区域；

⑤跟踪足够数量的鸟类(至少20只)。

第二步：检查所有观测鸟类是否都是觅食鸟，即个体PT>0，对于数据为0的观测鸟类个体，则排除该鸟的数据。对于跟踪多于1d的观测鸟类个体，使用每日PT的平均值作为该个体的PT。

第三步：计算觅食鸟个体PT数据的第90百分位，即可得出风险评估中使用的PT。

从风险评估的原理上来说，在长期风险评估中使用21d时间加权平均PT是合理的，但目前尚无在农药风险评估中使用多个体、多天的跟踪数据的导则。Ludwigs等[12]提出了利用蒙特·卡罗方法计算21d平均PT的方法。

5.2 PD 在优化PD时，可以通过分析鸟类胃内容物、粪便和食丸来确定鸟类的食物来源。

5.2.1 捕鸟及样品采集 可使用网或陷阱捕捉观测鸟类。试验应在合适的季节进行，网或陷阱应放置在目标作物或至少靠近目标作物。试验地点应代表农药的使用地点。捕捉观测鸟类后，可通过获取粪便或胃内容物样品来获取鸟类的饮食样品。通常，粪便样品会提供更可靠的结果。

(1)粪便采样

可将观测鸟类放在干净的袋子或聚乙烯片上收集粪便。也可以在田间(例如鸟类停留地、栖息地、筑巢地)收集粪便。粪便样品应单独存放，可用氯化钠保存。

(2)胃内容物取样

将涂有凡士林的细塑料管插入胃中，通过注射器将温水泵入胃中，直到食道和胃的内容物排空。将获得的样品转移到样品容器中并用酒精保存。

5.2.2 收集参照物 在试验区域采集鸟类食物(如无脊椎动物、种子或植物)，可帮助估计鸟类食物的原始尺寸。

5.2.3 样品检测 用显微镜研究鸟类的食物样品。昆虫遗骸至少区分至科，其他无脊椎动物至少区分至纲。通过分析角质层的结构，特别是气孔可以确定食物样品中的植物种类。通过分析外壳残留物来识别种子。

无脊椎动物或植物的特征部分(例如节肢动物的几丁质碎片、蚯蚓的刚毛、种子碎片(果皮)、植物(即叶子和茎的面积))的大小可以用测微目镜测定。

为量化不同类型食物的数量(例如节肢动物的数量)，应对每个样品中发现的食物碎片计数，并计算出占指定残骸数量所需的最小个体数据。例如甲虫的两个右下颌骨和一个左下颌骨可归因于至少两个个体。果实和种子的数量可通过测量碎片的面积并将其除以参照果实或种子的面积来获得。

试验结果的质量在很大程度上取决于操作人员识别遗骸的能力。提前捕捉观测鸟类并喂食不同食物有助于量化食物样品回收率。

5.2.4 数据评估

(1)将样品中的食物数量转化为鸟类实际摄入的食物数量

使用校正因子将粪便或胃内容物样品中食物数量转化为鸟类实际摄入的食物数量。消化过程中在某些食物几乎完整的情况下，另一些食物可能已完全消失，因此每种类型的食物需使用特定的校正因子。蚯蚓或其他土壤无脊椎动物通常被迅速消化，而许多节肢动物的角质层部分通常不易消化而容易在粪便中识别出来。某些食物类型和鸟类的校正因子可从文献中得出[13，14]。也可以捕捉鸟类在圈养条件下进行饲喂试验，以确定校正因子。

(2)根据摄入食物的长度计算食物的干重

可使用相关文献[15，16]中的回归方程将估算的食物长度转换为食物干重。

5.2.5 注意事项 有关食物组成的数据应与申请的用途有关，即与栖息地和施药时间都有相关性。应注意，该数据可能会低估蚜虫等易消化食物的比例。

然后使用上述数据重新计算风险商值。对于摄入多种食物的情况，应计算每种食物类型的预测暴露剂量，并将其相加以获得总预测暴露剂量。

优化PD时，应注意以下几点：

——优化PD并不总是导致RQ减小；

——PD值总和应为1；

——饮食构成的假设应充分合理；

——数据应先换算为干重，然后再用于估算PD。

——如果施药区域和未施药区域的饮食组成不同，应基于施药区域的饮食数据估算PD。

6 确定长期毒性试验终点的相关性

环境风险评估的目标是预测对种群水平的影响，一般认为如果不影响个体的存活率、繁殖率和发育，则不会对种群产生影响。因此，毒性试验中只有与这些关键因素有关的终点才具有生态毒理学意义。无可观察作用水平(NOEL[1])基于试验的最敏感端点，在高级评估中可以考虑高于NOEL的剂量所见效应的生态相关性。

6.1 终点类别 鸟类繁殖毒性试验包括成鸟和繁殖的终点。如果NOEL基于繁殖的终点，但暴露时间是在繁殖季节以外短暂发生的，则基于成鸟影响的NOEL更相关。

6.2 繁殖终点 通常应选择与总体繁殖率相关的终点来定义鸟类的长期NOEL。根据具体情况和数据情况，可能是繁殖率、幼鸟的生存率或生长率、成鸟或幼鸟的行为参数。

6.3 毒性效应的大小 NOEL是基于统计显著性而非生物学显著性。在高质量的鸟类繁殖试验中，有可能表明5%的孵化重量的偏差具有统计显著性，而在普通试验中不具有统计显著性。如果第14d幼鸟体重正常，则不将这种效应视为生物学相关。应避免根据经验判定与对照相比的20%或其他任何差异为相关。相反，在质量较差的试验中，统计学上无显著性差异并不一定意味着没有生物学上的显著影响。

6.4 效果随时间的变化 暴露终止后短时或可逆的亚致死作用不如连续或不可逆作用重要。

7 研究鸟类的去壳行为

对于吃种子的鸟类，去壳行为可降低农药暴露。可观察到去壳行为的主要是小型鸟类，但并非所有小型鸟类都有去壳行为，某些物种对部分特定种子类型存在去壳行为。在野外，去壳行为可能取决于摄食压力、捕食或竞争等胁迫。对于体重超过50g的鸟类，应假定没有去壳行为。

关于鸟类的去壳行为对农药暴露的定量研究很少，现有数据表明鸟类摄食去壳种子的数量及去壳行为对农药暴露量的减少都与种子结构密切相关。由于缺乏可靠数据，必须有证据表明关键物种在田间条件下存在去壳行为。此外，如果一个或几个种子或颗粒剂中含有的农药有效成分已达到该农药对鸟类的半致死剂量时，也不考虑鸟类的去壳行为。

为明确去壳行为对农药暴露的影响，应对相关的鸟类关键物种、种子类型和农药开展试验，避免外推增加不确定性。如果风险评估中考虑了鸟类的去壳行为，则同时应评估没有去壳行为的鸟类物种的风险。如果评估结果表明没有去壳行为的鸟类物种的风险不可接受，则风险仍不可接受。