冷冻贮苗对当归早薹、生物量和品质的影响

黎洁，刘晓霞，罗蜜蜜，黄天苗，谢雕雕，2，张海燕，栗孟飞，，魏建和

(1.甘肃农业大学干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州 730070；2.甘肃绿能农业科技股份有限公司，甘肃 武威 733200；3.兰州新区现代农业发展研究院有限公司，甘肃 兰州 730300；4.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193)

当归为常用大宗药材，来自多年生草本植物当归(Angelicasinensis(Oliv.)Diels)的干燥根，具有补血活血、调经止痛和润肠通便等功效，现多用于治疗贫血、妇科疾病、卒中等症[1-2]。化学研究表明，当归含有阿魏酸、藁本内酯、多糖、黄酮和酚类等多种化学成分[2-3]。当归主产于我国甘肃、四川和云南等高寒阴湿地区，年需求量超过3万t，年在地面积约4.4万hm2以上[4-6]。目前生产中，当归第2年收获肉质根用作药材，留存于地中的根第3年抽薹开花收获种子用于种苗繁育[6]。然而，30%～50%的植株第2年就出现提前抽薹开花(即早薹开花)，使得肉质根木质化不能入药[1，7]。种植中早薹开花导致严重减产问题一直是多年来困扰当归优质药材生产的严重问题之一[6]。

很多研究表明，当归为“低温长日照型”植物，即植株由营养生长转入生殖生长必须同时满足低温春化作用和长日照[7-9]。由于春化阶段主要发生在种苗越冬贮存期间，贮存空间小便于集中控制温度；而光照阶段必须发生在种苗移栽后的正常生长期间，田间栽培空间大难以大面积缩短日照时间[8]。因此，从实际生产来看，控制春化阶段远比控制光照阶段更加可行。研究发现，当归种苗春化作用温度为0～5℃，也即规避春化作用的温度为：<0 ℃贮苗、>5 ℃贮苗或0～5 ℃贮苗期间给予一定时间高温(约30 ℃)[6，8]。研究表明，<0 ℃贮苗最为可行，因为>5 ℃和高温“去春化”贮苗方式，极易出现种苗腐烂等问题[8,10]。

前人研究发现，通过对越冬期当归种苗进行-4～-2 ℃和-12～-10 ℃贮藏，移栽后早薹率分别降低至5.6%和0[10]。但冷冻贮苗温度并不是越低效果越好，温度越低种苗移栽后返青时间越长，且生长势越弱，产量降低[7，11]。综合文献资料显示，到目前为止，对于种苗冷冻贮藏的研究仅局限于早薹率统计和产量评估，而对于冷冻贮苗后成药根品质，以及冷冻贮藏对不同种苗类型的影响还未见研究报道。为此，本研究以不同类型当归种苗为材料，就不同贮藏温度(0和-5 ℃)移栽后，进行植株早薹率、成药根生物量、主要活性物质含量以及抗氧化能力测定与分析，旨在为选择适宜的当归种苗冷冻贮藏条件提供理论基础与依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019～2020年在甘肃绿能农业科技股份有限公司(海拔2 423 m；E 103°07′39.21″，N 37°01′0.45″)进行。2019年10月底，采集当归(岷归1号)一年生正常种苗(岷县茶埠镇沟门村，海拔2 349 m；E 104°06′22.31″，N 34°28′54.94″)和火药籽苗(岷县闾井镇小巩滩村，海拔2 773 m；E 104°36′33.97″，N 34°20′05.50″)，将种苗含水量晾至约70%，分别置于0和-5 ℃冰箱中冷冻贮藏。

降温和贮藏方法：首先，将温度降温至0 ℃，0 ℃处理保持恒温；-5 ℃处理先在0 ℃处理3 d，然后以1 ℃/d降温至-5 ℃，并恒温贮藏；2020年4月初，按照1 ℃/d梯度升温至0 ℃，解冻后取出用于田间栽培。需要强调的是，种苗贮藏期间保证供电。

1.2 仪器与试剂

ACQUITY Arc型四元梯度超快速液相色谱仪(Waters公司，美国)，Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm，美国)，V1800 型可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。阿魏酸(ferulic acid，中国食品药品检定研究院，批号110773-201915)，藁本内酯(ligustilide，北京索笛计量科技有限公司，批号20041005)，没食子酸(质量分数≥90%，天津市凯信化学工业有限公司)和儿茶素(质量分数≥98%，北京索莱宝科技有限公司)，其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 种苗分级与移栽 种苗解冻后，首先，按照根茎大小进行分类：小苗(0.3～0.4 cm)、中苗(0.4～0.5 cm)和大苗(0.5～0.6 cm)；其次，分别挑选无损伤、无叉根、有根系活力的种苗20株用于移栽，每处理3次重复；然后，移栽定植于日光温棚，定植前一次性施入甘肃绿能农业科技股份有限公司“绿能瑞奇牌”复合微生物肥(1 350 kg/hm2)作底肥。每个处理定植面积约3 m2，种植方式为覆黑膜垄作，行株距20 cm×20 cm，穴深15 cm，每穴1株。生长期间采用统一常规田间管理，不再施肥，土壤含水量控制在25%～30%，温度控制在10～28 ℃。

1.3.2 早薹率统计和生物量测定 2020年8月中旬，统计不同处理抽薹株数，抽薹率(%)=抽薹株数/20株×100%；10月中旬地上部分枯萎时，采挖植株根部，流水冲洗干净后置于室温通风处阴干，测定植株干质量。

1.3.3 活性物质含量及抗氧化能力测定

1.3.3.1 提取液的制备 取阴干的根茎粉碎后过0.18 mm筛，准确称取0.2 g置于250 mL圆底烧瓶中，加入20 mL 70%甲醇，称定质量，60 ℃加热回流提取30 min，自然冷却至室温，再称定质量，用70%的甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，在4 ℃、5 000 r/min条件下离心10 min，取上清液-20 ℃保存，用于阿魏酸、藁本内酯、可溶性糖、总酚类和总黄酮类化合物含量以及体外抗氧化能力测定。

1.3.3.2 阿魏酸和藁本内酯含量的测定 采用HPLC法测定阿魏酸和藁本内酯的含量，参考邓雪琪等[12]的方法测定。具体步骤：将1.3.3.1中提取液用0.22 μm有机滤膜过滤，进样量10 μL，体积流量1.0 mL/min，检测波长323 nm，柱温30 ℃，流动相为1.0%乙酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱为(0～8 min，38%～90% B；8～12 min，90%～38%B；12～14 min，38% B)。

以阿魏酸和藁本内酯为对照品，采用梯度质量浓度稀释法用色谱甲醇配制，依次配制成混合质量浓度分别为0.03、0.08、0.20、0.51、1.28 μg/mL的阿魏酸对照品溶液和3.20、8.00、20.00、50.00、100 μg/mL的藁本内酯对照品溶液；以峰面积(Y)对质量浓度(C)进行回归计算，得到阿魏酸对照品回归方程为Y=3.40×105C1-9742.3(R2=0.999)，藁本内酯对照品回归方程为Y=4.68×103C2+8 534.1(R2=0.998)，样品中阿魏酸和藁本内酯含量计算公式如下：

阿魏酸含量(mg/g)=

单株阿魏酸含量(mg/株)=阿魏酸含量×单株干质量

单株藁本内酯含量(mg/株)=藁本内酯含量×单株干质量

式中：C1为样品中阿魏酸质量浓度(μg/mL)；C2为样品中藁本内酯质量浓度(μg/mL)；Y为样品峰面积(mAU×s)；V为提取液的体积(mL)；M为制备提取液材料的干质量(g)。

1.3.3.3 可溶性糖含量的测定 可溶性糖含量的测定采用硫酸苯酚法，参考栗孟飞等[5]和Dubois等[13]的方法。其中，测定时提取液加样量均为15 μL，以蔗糖为标准品标定可溶性糖的含量，计算公式为：

单株可溶性糖含量(mg/株)=可溶性糖含量×单株干质量

标准曲线方程C(μg)=126.58A-6.89(R2=0.993)

式中：C为可溶性糖的量(μg)；V1为吸取样品溶液的体积(mL)；V2为提取液的体积(mL)；A为样品的吸光值；M为制备提取液材料的干质量(g)。

1.3.3.4 总黄酮类化合物含量的测定 总黄酮类化合物含量的测定采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法，参考栗孟飞等[5]和Lay等[14]的方法。其中，测定时提取液加样量均为1.5 mL，以儿茶素(catechin，CE)为标准品标定总黄酮类化合物的含量，计算公式为：

单株总黄酮类含量(mg/株)=总黄酮类含量×单株干质量

标准曲线方程C(CE μg)=192.31A-4.17(R2=0.999)

式中：C为黄酮类的量(μg)；V1为吸取样品溶液的体积(mL)；V2为提取液的体积(mL)；A为样品的吸光值；M为制备提取液材料的干质量(g)。

1.3.3.5 总酚类化合物含量的测定 总酚类化合物含量的测定采用福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂法，参考栗孟飞等[5]和Beato等[15]的方法。其中，测定时提取液加样量均为100 μL，以没食子酸(gallic acid，GAE)为标准品标定总酚类化合物的含量，计算公式为：

单株总酚类含量(mg/株)=总酚类含量×单株干质量

标准曲线方程C(GAE μg)=16.78A-0.26(R2=0.996)

式中：C为酚类的量(μg)；V1为吸取样品溶液的体积(mL)；V2为提取液的体积(mL)；A为样品的吸光值；M为制备提取液材料的干质量(g)。

1.3.3.6 体外抗氧化能力的测定 采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)和铁离子还原/氧化能力(ferric reducing/antioxidant power，FRAP)2 种方法测定提取液的体外抗氧化能力。

DPPH法参考栗孟飞等[5]、Li等[16]和Nencini等[17]的方法测定。其中，测定时提取液加样量均为200 μL，抑制率的计算公式为：

式中：A为样品溶液吸光值；A0为不加样品溶液的吸光值；M为材料单株干质量(g)。

FRAP测定参考栗孟飞等[5]、Li等[16]和Benzi等[18]的方法测定。其中，测定时提取液加样量均为100 μL，以FeSO4·7H2O(500 μmol Fe(Ⅱ)/g)为参比基础计算样品溶液的抗氧化能力，FRAP值计算公式为：

单株FRAP值(μmol Fe(Ⅱ)/株)=

式中：A为样品溶液吸光值；AFeSO4·7H2O为FeSO4·7H2O溶液的吸光值；A0为不加样品溶液的吸光值；M为材料单株干质量(g)。

1.4 统计与分析

每个试验重复3 次，采用SPSS 22.0 软件进行One-Way ANOVA Duncan 数据差异显著性分析；采用Microsoft Office Excel 2007进行制图。

2 结果与分析

2.1 冷冻贮藏对当归早薹的影响

图1结果显示，与0 ℃相比，-5 ℃处理下正常种苗和火药籽苗的早薹率均呈现不同程度的降低，就正常种苗而言，中苗和大苗分别降低了63.6%和21.9%；同一温度和种苗大小相同的情况下，移栽后植株早薹率均呈现正常种苗低于火药籽苗；另外，早薹率均随种苗的增大而增加。

不同小写字母分别表示在P<0.05水平下达到显著性差异。

2.2 冷冻贮藏对当归成药根生物量的影响

图2结果显示，与0 ℃相比，-5 ℃处理正常种苗和火药籽苗的成药根单株干质量均显著降低，-5 ℃正常小、中和大苗分别较0 ℃降低36.7%、34.5%和20.7%；同一条件下，成药根单株干质量均呈现正常种苗高于火药籽苗；另外，随着种苗的增大成药根单株干质量均显著增加。

不同小写字母分别表示在P<0.05水平下达到显著性差异。

2.3 冷冻贮藏对当归成药根中阿魏酸和藁本内酯含量的影响

图3结果显示，与0 ℃相比，-5 ℃处理正常种苗和火药籽苗成药根中阿魏酸含量，以干质量和单株计算有所降低，正常种苗小苗以及火药籽苗大苗干质量除外；而藁本内酯含量有所增加，中苗则相反。同一条件下，阿魏酸和藁本内酯含量呈现正常种苗高于火药籽苗，0 ℃处理小苗除外。

不同小写字母分别表示在P<0.05水平下达到显著性差异。

2.4 冷冻贮藏对当归成药根可溶性糖、总黄酮类和酚类化合物含量的影响

图4结果显示，冷冻贮藏对成药根可溶性糖、总黄酮类和酚类化合物含量也呈现不同程度的影响。与0 ℃相比，-5 ℃处理下正常种苗和火药籽苗成药根中可溶性糖含量，以干质量和单株计算均有所降低(图4-A和4-B)；总黄酮类和总酚类化合物含量也基本呈现降低的趋势(正常种苗小苗干质量除外)(图4-C～4-F)。正常种苗与火药籽苗进行比较，发现0 ℃处理下不同种苗大小之间无规律性差异变化，-5 ℃处理下呈现为正常种苗高于火药籽苗。

不同小写字母分别表示差异显著(P<0.05)。

2.5 冷冻贮藏对当归成药根抗氧化能力的影响

图5结果显示，与0 ℃相比，-5 ℃处理下正常种苗和火药籽苗成药根的DPPH清除率和FRAP值，以干质量和单株计算均有所降低(正常种苗小苗干质量除外)；正常种苗与火药籽苗进行比较，发现0 ℃处理下不同种苗大小之间无规律性差异变化，-5 ℃处理下呈现为正常种苗高于火药籽苗，这与可溶性糖、总黄酮类和总酚类化合物含量的变化基本一致。

不同小写字母分别表示在P<0.05水平下达到显著性差异。

3 讨论与结论

对于冬性植物而言，春化作用和光周期在诱导成花过程中同等重要，通常表现为春化作用可使分生组织获得向花器官转变的能力，然后给予适宜的光照才能保证开花；若植物没有完成春化作用，即使给予适宜的光周期也会延迟开花或一直处于营养生长阶段；同时，植物春化速率与温度和时长存在累加效应和函数关系，但不同植物、品种、年龄、大小和营养水平等对春化作用的影响不尽相同[19-21]。研究已证实，当归为冬性植物，其抽薹开花受到内因(如种源、苗龄和大小等)和外因(如温度、光照和海拔等)的共同作用[6]。

针对种源和种苗大小影响植株早薹率和成药根生物量，本研究发现，无论在春化作用温度(0 ℃)或规避春化作用温度(-5 ℃)，同一种苗大小相同的情况下，正常种苗移栽后不仅抽薹率均低于火药籽苗，而且成药根生物量显著增加；尽管早薹率随种苗的增大而增加，但是随着种苗的增大成药根生物量显著增加，这与前人的研究报道一致[4，11，22-23]。以上结果表明，在生产过程中，首先，应选择正常种苗进行种植栽培，以降低早薹发生；其次，应选择中等种苗(0.4～0.5 cm)，在保证降低早薹发生的同时，相对提高成药根产量。

针对冷冻贮苗影响植株早薹率和成药根生物量方面，本研究发现，对于正常种苗而言，中苗和大苗在-5 ℃贮藏相对于0 ℃可显著降低早薹率，而小苗影响不显著。这与前人研究的较小的当归种苗(百苗质量<20 g)对低温的感受力较差，在一定的时间内不能完成春化作用的结果基本一致[24]。同时，-5 ℃贮藏正常种苗移栽后的成药根生物量显著降低了20.7%～36.7%。这与贾贞等[11]研究发现-5 ℃贮藏成药根生物量相对于0 ℃显著降低的结果基本一致[11]。

通常而言，低于0 ℃的温度不仅使细胞代谢活性受到抑制，而且还阻止细胞分裂和DNA复制，最终使得植物不能通过春化作用[19,25]。贮藏温度越低，恢复生长所用时间越长。贾贞等[11]通过对冷冻贮藏的当归种苗进行延迟栽培，发现成药根的产量随栽期的延后而减小。这间接佐证了-5 ℃贮藏的种苗由于恢复时间长，延迟并缩短了生长发育时期，进而限制了光合产物以及代谢产物的积累，不仅降低了成药根生物量，而且在一定程度上降低了主要活性物质(阿魏酸、藁本内酯、可溶性糖、总黄酮类和总酚类)的积累量及其抗氧化能力。

理论上而言，不同类型的当归种苗必然存在一个最佳的冷冻贮藏温度，可保证最高存活率、最低抽薹率、最高成药根生物量以及活性物质积累量。本试验仅对不同类型的当归种苗进行了-5 ℃冷冻贮藏的研究，因此，对于不同类型种苗的冷冻贮藏最佳温度，以及冷冻贮藏调控抽薹开花的分子机制，还需要进一步的研究与分析。