UFLC法同时测定芍药甘草汤中甘草苷和甘草酸的含量

崔 悦，王佳楠，范琢玉，汤鑫淼，冯 波，关 皎，朱鹤云

(吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013)

芍药甘草汤是由白芍、甘草配伍而成的中药复方汤剂，其应用历史悠久，疗效显著，早在汉代张仲景所著《伤寒论·辨太阳病脉证并治》中便有记载。方中白芍养血敛阴，甘草补脾益气，两者相伍，可生缓急止痛之效。药理研究表明，芍药甘草汤可抗炎镇痛、保肝利胆，临床常用于多种痛症[1]。

中药理论有“十方九草”之说，也就是说甘草在中药传统方剂中使用频繁。甘草含有三萜皂苷类、黄酮类、生物碱类和多糖类等成分，其中三萜皂苷类(代表药物为甘草酸)和黄酮类(代表药物为甘草苷)是甘草中的主要活性成分。研究表明，甘草酸具有抗病毒、抗炎、抗氧化、调免疫、促吸收等多种药理活性[2-3]，甘草苷具有抗抑郁、保肝、神经保护、心肌保护等作用[4-6]。目前甘草的质量研究多采用紫外法[7]、荧光法[8]、高效液相色谱法[9-10]等方法。然而，这些方法样品前处理复杂、专属性和灵敏度较差、分析时间过长。超快速液相色谱(ultra-fast liquid chromatography，UFLC)技术分析效率高、溶剂消耗少，广泛应用于中药复方的研究中[11-12]。本研究采用UFLC法同时测定芍药甘草汤中甘草苷和甘草酸的含量，可为芍药甘草汤的质量控制提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 仪器与材料

Prominence UFLC型超高快速液相色谱仪(日本岛津)；XK96-A快速混匀器(江苏新康医疗器械有限公司)；N-1300-WB型旋转蒸发仪(日本EYELA东京理化器械株式会社)。

芍药、甘草药材(产地：内蒙古，购自吉林大药房)，由吉林医药学院李景华副教授进行鉴定，确定为真品；对照品甘草苷(中国食品药品检定研究院，111610—201607，纯度>98%)，甘草酸(成都普菲德生物技术有限公司，151014，纯度>98%)。色谱纯乙腈和甲醇(美国Fisher公司)。

1.2 色谱条件

色谱柱为Shimadzu Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm，2.2 μm)；流动相为0.1%磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～4 min，5%～20%B；4～12 min，20%～40%B；12～15 min，40%～45%B)，流速为0.8 mL/min，检测波长为237 nm，柱温为30 ℃，进样量5 μL。甘草苷和甘草酸典型色谱图见图1。

1.甘草苷；2.甘草酸

1.3 对照品溶液的配制

取甘草苷和甘草酸对照品，用甲醇配制成甘草苷和甘草酸为1.0 g/L的对照品储备液。

1.4 供试品溶液的制备

1.4.1芍药甘草汤的制备

按照《伤寒论》所述，取药材白芍12 g，炙甘草12 g，加10倍水煮沸1 h，过滤，残渣再次回流1 h，将第1次与第2次回流提取的滤液合并于干净的容器内，用旋转蒸发仪旋蒸浓缩至50 mL，置于容量瓶中所得即芍药甘草汤。

1.4.2芍药甘草汤供试品溶液制备

精密吸取上述芍药甘草汤0.5 mL，加入甲醇25 mL超声30 min，上清液用0.22 μm滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。

1.5 线性关系考察

吸取甘草苷和甘草酸对照品溶液，置于相同5 mL容量瓶中，用甲醇配制成甘草苷和甘草酸浓度均为2、5、10、20、50、100 mg/L的系列混合对照品溶液，以色谱峰面积积分值为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标，求线性方程。

1.6 精密度试验

吸取混合对照品溶液，甘草苷与甘草酸浓度均为50 mg/L，按上述色谱条件，连续进样6次。

1.7 稳定性试验

取同一批次的芍药甘草汤样品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样分析。

1.8 重复性实验

取同一批芍药甘草汤样品共6份，并制备供试品溶液，计算两成分的含量。

1.9 回收率试验

向已知含量的芍药甘草汤样品(甘草苷0.398 mg/L、甘草酸含量0.647 mg/L)9份(0.25 mL/份)中加入相当于样品中含量80%、100%、120%的对照品各3份，分析并计算回收率。

1.10 样品含量测定

测定并计算6 批芍药甘草汤供试品溶液中两成分的含量。

2 结 果

2.1 线性关系考察

获得甘草苷、甘草酸的线性回归方程分别为：

Y=4.3614×104X-2.887×104，r=0.999 8

Y=1.058×104X-9.981×103,r=0.999 4

两种成分在2～100 mg/L线性关系良好。

2.2 精密度试验

两种成分峰面积的RSD分别为0.6%和1.0%，即仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验

两种成分峰面积的RSD分别为0.9%和2.9%，即样品具有良好的稳定性。

2.4 重复性试验

两种成分的含量分别为0.398 mg/L(RSD为2.3%)和0.647 mg/L(RSD为1.7%)，即方法的重复性符合要求。

2.5 回收率试验

芍药甘草汤中甘草苷和甘草酸的回收率分别为98.8%和99.1%(表1)。

表 1 芍药甘草汤中甘草苷和甘草酸的回收率

两种成分的含量见表2。

表 2 芍药甘草汤样品中甘草苷和甘草酸的含量(g/L)

2.6 含量测定

3 讨 论

本实验考察比较了多种水相和有机相做为流动相，包括添加不同种类酸(甲酸和磷酸)和不同浓度酸(0.1%和1%)的水、甲醇、乙腈。以基线、分离度等作为评价指标。最终选择乙腈-0.1%磷酸水做为流动相。

实验采用PDA检测器在200～400 nm波长范围内对样品进行扫描，甘草苷和甘草酸分别在276 nm和248 nm处有最大吸收。综合比较，237 nm波长下两种成分峰响应值较高，故选定其为检测波长。

芍药甘草汤是由芍药、甘草配伍所得，两者协同调和肝脾、柔筋止痛。研究表明，芍药甘草汤的原方入血成分多达17种，因此对原方中化学成分的整体研究十分重要[13]。本研究选取甘草中两种活性成分即甘草苷和甘草酸，建立了同时检测芍药甘草汤中这2种水溶性成分的UFLC方法，与已有方法比较更加快速、分离效果更佳[9]。通过测定得知，购自吉林大药房的炙甘草药材均符合药典要求(甘草苷含量不低于0.50%，甘草酸含量不低于1.0%)。本研究从定量的角度，对经典名方芍药甘草汤的物质基础进行了初步研究，建立了芍药甘草汤稳定、简便的UFLC测定方法，可为其新剂型开发提供参考。