霍山石斛多糖对MPTP诱导的帕金森病小鼠模型的神经保护作用

刘 川，高 妍，张 赫

(北华大学附属医院神经科，吉林 吉林 132000)

研究表明PD发生及发展与小胶质细胞过度活化而引发的炎症反应相关[4]。小胶质细胞是一种免疫细胞，在神经系统内发挥免疫监视作用，内环境变化可诱导小胶质细胞活化，介导白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎性因子的释放[5]。霍山石斛多糖(Dendrobium huoshanense polysaccharide，DHP)具有广泛的生物活性，可调节免疫、抗炎抑菌、降低氧化应激、抗肿瘤等[6]。目前DHP在PD中的作用尚不明确。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin，MPTP)能够通过破坏小鼠脑黑质中多巴胺能神经元功能诱发典型的PD样改变[7]。

本实验通过建立PD小鼠模型，旨在研究DHP对MPTP诱导的PD小鼠模型的运动功能缺陷及神经炎症的影响，从而探讨DHP能否作为PD等神经退行性疾病新的治疗药物。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

旷场实验全自动记录仪(赛昂斯生物科技有限公司)，IL-1β和TNF-αELISA检测试剂盒(索莱宝科技有限公司)。

1.2 实验动物

清洁级雄性C57小鼠40只，体质量(23±3)g，购自吉林大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(吉)2010-0005。实验开始前适应性饲养7 d，饲养环境为SPF级动物房，自由饮水摄食，温度(22±2)℃，湿度(50±5)%,人工光照12 h昼夜交替。本实验严格遵循《实验动物护理和使用指南》。

1.3 小鼠PD模型及实验分组

小鼠适应性饲养一周后随机分为5组，对照组，PD模型组，DHP低(25mg/kg)、中(50 mg/kg)、高(100 mg/kg)三个剂量组，每组各8只。参照文献建立PD模型[8]。PD模型组:C57小鼠于每天上午8点先行灌胃等体积生理盐水，连续3 d，其后于上午8点灌胃等体积生理盐水并10点腹腔注射MPTP 30 mg/kg，连续5 d后模型成立，其后4 d上午8点灌胃等体积生理盐水。DHP各剂量组:每天上午8点先行灌胃各剂量DHP，连续3 d，其后在上午8点灌胃各剂量DHP，10点注射MPTP 30 mg/kg，连续5 d，其后4 d上午8点灌胃各剂量DHP；对照组:C57小鼠给予等体积生理盐水。所有小鼠于第13天进行行为学测试，测试后处死小鼠留取血清进行炎症因子检测。

1.4 悬挂实验

自制一根悬挂麻绳用于小鼠的悬挂实验。实验前将小鼠悬挂于一根麻绳上，离地高度30 cm，观察小鼠后肢抓绳状况，进行评价。两后肢均抓绳记3分，一只抓绳记2分，均不抓绳记1分，实验重复5次取平均值。

1.5 旷场实验

应用自发活动观察系统进行本实验。分别将每只小鼠以头部向前的方式置于观察箱中心位置，分别采集5 min总运动距离、停留中央格时长，同时人工记录站立次数。检测每只小鼠前，用75%酒精对观察箱进行擦拭，以消除气味及排泄物影响。

1.6 爬杆实验

参考Arai[9]方法自制爬杆测试装置。取直径1 cm、长度0.5 m的木杆，顶端插入一枚泡沫球，木棍表面缠绕纱布以避免小鼠打滑。将各组小鼠分别置于泡沫球上，以小鼠向下运动为即时起点，运动至小鼠四肢全部着地计时结束，记录本时长为爬行潜伏期。每只实验鼠连续测试5次，取平均值，检测间隔时长2 min。若出现小鼠掉头或停止爬行，重新开始本次测试。检测每只小鼠前，用75%酒精对泡沫球及爬杆进行擦拭，以消除气味及排泄物影响。

1.7 炎症水平评价

采集小鼠血液样本，4 ℃，3000 r/min离心10 min。收集血清，用IL-1β、TNF-α试剂盒分析不同组别小鼠IL-1β和TNF-α的活性水平。所有操作按试剂盒说明书进行，酶标仪检测450 nm处吸光度值。

共140例患者用于建模，其中按1∶1的比例随机分为训练集和验证集。训练集与验证集的临床参数差异均无统计学意义。在总的18个临床参数，经LASSO算法筛选后，在图1中交叉验证误差最小时的lambda处，得到5个与进展期鼻咽癌患者远处转移密切相关的参数，分别是血清EBV DNA，中性粒细胞计数/淋巴细胞计数（NLR），治疗前血清VCA-IgA抗体，同步放化疗，诱导化疗。

1.8 统计学处理

使用SPSS22.0对数据进行分析，以均数±标准差表示，数据服从正态分布且方差齐。两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，组内比较采用SNK法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 悬挂实验结果

对照组小鼠肢体协调，两后肢均可抓绳，评分均为3分。PD模型组，DHP低、中剂量治疗组小鼠评分分别为(1.89±0.31)分、(1.87±0.24)分和(1.96±0.67)分，与对照组相比评分显著降低，后肢协调能力下降明显，差异有统计学意义(P<0.01)。高剂量治疗组小鼠评分为(2.79±0.23)分，与对照组相比下降不明显，与模型组比较评分明显提高，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 旷场实验结果

与对照组相比，PD模型组小鼠总活动距离和站立次数明显减少(P<0.01)，中央格停留时长增加(P<0.01)；与模型组相比，DHP治疗组小鼠的水平和垂直运动能力增强，总活动距离延长，站立次数增多，中央格停留时间延长，随着DHP用药剂量加大，小鼠运动能力逐渐增强。其中DHP高剂量小鼠总活动距离比PD模型组小鼠增加了45.40%，站立次数增加65.92%，中央格停留时长减少了35.59%，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表1。

表 1 小鼠旷场实验结果

2.3 爬杆实验结果

对照组小鼠下滑时间为(5.98±0.31)s，小鼠下滑动作敏捷平顺。PD模型组小鼠动作不协调，下滑过程中出现卡顿，时长为(10.01±1.2)s，与对照组相比增加了67.39%，差异有统计学意义(P<0.01)。DHP治疗后缓解了小鼠动作迟缓症状，DHP低、中、高剂量组小鼠下滑潜伏期分别为(9.11±0.28)s、(8.48±0.76)s和(6.19±0.35)s，表现为随着DHP剂量增加小鼠下滑潜伏期缩短，其中DHP高剂量组下滑时长与模型组相比缩短了38.16%，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4 DHP对MPTP诱导的PD小鼠炎症水平的影响

ELISA结果显示，与对照组相比，模型组小鼠血清中IL-1β(P<0.05)和TNF-α(P<0.01)的含量显著增加；而与模型组相比，DHP处理后，炎症因子水平降低，且随着DHP剂量增加，炎症因子水平降低更为明显，其中DHP中、高剂量组小鼠血清中的IL-1β、TNF-α与模型组相比明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。结果见图1。

与对照组相比**P<0.01,与模型组相比##P<0.01图 1 DHP对MPTP诱导的PD小鼠血清中IL-1β和TNF-α的影响

3 讨 论

PD已成为全球发病率占第2位的神经退行性疾病，老年人口受威胁人数占比1%[10]。而目前临床治疗用药并不能从根本上减少疾病的发生及减缓病

情进展，且副作用较多，因此探索更为有效的药物具有重要意义。本研究旨在研究DHP对MPTP诱导的PD小鼠模型是否具有神经保护作用及其可能的作用机制。结果显示，与PD模型组相比DHP高剂量组小鼠的运动协调能力得到明显改善，炎症水平显著降低，说明DHP能够改善PD小鼠症状，可作为PD等神经退行性疾病新的药物进行进一步探索。

药理学研究表明，DHP具有广泛的生物活性[11]。文献报道[12]，DHP在二甲苯致小鼠肿胀模型和急、慢性小鼠炎症模型中具有抗炎消肿作用，降低了血液中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平；在鸡蛋液诱导的大鼠足肿胀模型中，DHP能够缓解足肿胀度；Ge等[13]通过香烟烟雾诱导的小鼠肺炎模型研究发现，DHP在降低血液炎症因子TNF-α和IL-1β水平及其信号通路NF-κB和MAPK相关蛋白的磷酸化水平中发挥关键作用。

悬挂实验是对运动协调能力进行评价的重要方法。本研究中MPTP损伤了小鼠的协调能力，经过25及50 mg/kg剂量DHP治疗效果改善不明显；但经100 mg/kg剂量DHP治疗后，小鼠后肢协调运动情况有显著改善。提示100 mg/kg剂量DHP可缓解MPTP诱导的PD小鼠后肢运动障碍情况。旷场实验是评估小鼠的焦虑情绪水平及观测小鼠的自发活动常用实验。本研究中，100 mg/kg剂量DHP可显著降低PD模型小鼠的中央格停留时长，增加总活动距离和站立次数，说明DHP对MPTP诱导的PD小鼠水平及垂直自发运动能力障碍有所改善，对焦虑情绪有缓解作用。爬杆实验是对四肢综合运动能力检测的一种方法，本研究结果中，模型组下滑潜伏期明显延长，下滑中卡顿现象频繁，而经100 mg/kg剂量DHP治疗后症状得到了明显的改善，提示DHP对MPTP诱导的PD小鼠四肢协调运动障碍有治疗作用。

研究证实，PD发病与多巴胺能神经元病变密切相关，其作用机制包含氧化应激和炎症反应等[14]。脑内小胶质细胞过度激活而引发了炎症反应，释放IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子[15]。机体炎症状态下，外周免疫细胞可通过血脑屏障进入中枢神经系统[16]，并通过旁分泌和内分泌信号干扰导致神经炎症，从而进一步加重了神经退行性变的发生及发展[17]。IL-1β和TNF-α是早期急性炎症标志因子，常用于炎症反应指标。TNF-α由小胶质细胞分泌，可诱导NO、谷氨酸等神经毒物的释放，促进炎性因子释放，放大炎症反应，并可干预Ca2+离子平衡，从而加速多巴胺能神经元的损伤，加重PD病症状。常庆庆等[18]报道，PD患者外周血及脑脊液中TNF-α水平明显高于一般人群。项鑫等[19]研究发现，PD大鼠外周血中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子水平明显升高。本研究中，PD模型组小鼠外周血中IL-1β和TNF-α水平明显升高，而经DHP治疗干预后有所下降，提示DHP对MPTP诱导的PD小鼠炎症反应有缓解作用。

综上所述，DHP可改善MPTP诱导引发的小鼠PD样症状，减轻运动缺陷表现，降低炎症反应，对神经系统具有保护作用，其机制可能与DHP的抗炎作用相关。