脱水穿心莲内酯对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响

张 磊，曾建华，虞 涛，闫 冰，刘 晴，孙美艳

(吉林医药学院检验学院，吉林 吉林 132013)

子宫内膜癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一，好发于围绝经期、绝经后女性。近年来，子宫内膜癌的发病率在世界各国均有增高趋势[1]。临床研究表明,雌激素长期、持续性刺激子宫内膜可能与子宫内膜癌发生相关，且绝经后延、绝经晚、不育、子宫内膜增生过度也是子宫内膜癌发生的危险因素[2-3]。穿心莲是一种广泛应用的中药，其药用部位为爵床科植物穿心莲的干燥地上部分，具有消炎作用，已有上千年的应用历史，被称为天然抗生素。脱水穿心莲内酯是穿心莲提取物的有效成分之一，属双萜内酯化合物，具有增强免疫功能、消炎和抗菌的作用[4-5]。亦有研究表明,脱水穿心莲内酯具有很强的抗肿瘤作用，可促进多种肿瘤细胞凋亡[6]，但鲜有关于脱水穿心莲内酯与子宫内膜癌的研究。本研究采用体外细胞培养的方法，利用MTT、流式细胞术检测脱水穿心莲内酯对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡的影响，利用Western blot检测凋亡相关的分子机制，为进一步研究脱水穿心莲内酯对子宫内膜癌增殖与凋亡的影响及机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人体子宫内膜癌细胞(Ishikawa)。

1640培养液(美国Sigma公司)；胎牛血清(美国Hyclon公司)；MTT试剂盒、AnnexinⅤ-FITC/双染凋亡试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；超净工作台(北京东联)；流式细胞仪(美国BD公司)；CO2细胞培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备)；酶标仪(德国BMG公司)。

1.2 细胞培养

将Ishikawa细胞接种于含有10%青-链霉素的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养，当细胞融合率达到80%～90%时，用胰蛋白酶进行消化并传代培养，取对数生长期的细胞用于实验研究。

1.3 MTT法检测细胞增殖率

将正处在对数期的Ishikawa细胞转接至96孔板(细胞密度为5×104/孔)37 ℃ 5%CO2培养24 h后，加入终浓度为0、40、160和320 μmol/L的脱水穿心莲内酯，其中0 μmol/L的脱水穿心莲内酯为对照组，每组设置6个复孔。分别培养24、48、72 h后，每孔每次加入MTT 20 μL，避光孵育3 h，加入DMSO 150 μL，用酶标仪检测细胞增殖率。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

将正处在对数生长期的Ishikawa细胞接至6孔培养板(细胞密度为1×105/mL)，37 ℃ 5%CO2培养24 h后，加入终浓度为0、40、160和320 μmol/L的脱水穿心莲内酯，以0 μmol/L的脱水穿心莲内酯为对照组，继续培养24 h，收集细胞并调整细胞密度为1×105/mL，PBS清洗细胞并离心。在冰浴中分别加入AnnexinⅤ及PI，置于阴暗处20 min，流式细胞仪检测细胞凋亡，并采用软件分析细胞凋亡率。

1.5 Western blot检测蛋白表达

Western blot法检测Ishikawa细胞中胱天蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease，caspase)-3和Bcl-2蛋白的表达情况。向Ishikawa细胞中分别加终浓度为0、40、160和320 μmol/L的脱水穿心莲内酯培养24 h后，收集各组细胞并将密度调整至1×105/mL。吸取1 mL细胞悬液，提取细胞总蛋白，并用Bradford蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白定量。根据待评估蛋白分子的分子量制备SDS-PAGE电泳凝胶。上样、电泳、转膜并密封2 h后加caspase-3、Bcl-2兔多克隆抗体(体积稀释比为1∶1000)和鼠抗人actin单克隆抗体(体积稀释比为1∶1000)，TBST洗膜3次，每次5 min。加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗(体积稀释比为1∶1000)，经洗膜、显色及曝光后，使用软件分析各条带灰度值，分析caspase-3及Bcl-2的表达水平。

1.6 统计学分析

采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析，计量数据用平均数±标准差(mean±SD)表示，多个样本均数比较采用方差分析，两样本均数比较采用t检验，P<0.05为样本差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脱水穿心莲内酯对子宫内膜癌细胞增殖能力的影响

MTT法检测脱水穿心莲内酯对Ishikawa细胞细胞增殖能力影响，实验结果表明，脱水穿心莲内酯浓度为40 μmol/L就能够显著抑制Ishikawa细胞的增殖，随着脱水穿心莲内酯浓度和作用时间的增加，其可以呈浓度依赖性的抑制子宫内膜癌细胞增殖(P<0.05)，图1。

图 1 脱水穿心莲内酯对子宫内膜癌细胞增殖能力的影响

2.2 脱水穿心莲内酯对子宫内膜癌细胞凋亡的影响

采用流式细胞仪检测脱水穿心莲内酯对Ishikawa细胞凋亡能力的影响，结果显示，用40、160、320 μmol/L的脱水穿心莲内酯处理子宫内膜癌细胞后，细胞存活率均明显降低。药物浓度越大凋亡率越高，分别为0、3.9%、8.3%、13.4%(P<0.05)，图2。

a.对照组;b.脱水穿心莲内酯40 μmol/L;c.脱水穿心莲内酯160 μmol/L;d.脱水穿心莲内酯320 μmol/L图 2 脱水穿心莲内酯对子宫内膜癌细胞凋亡的影响

2.3 脱水穿心莲内酯对子宫内膜癌细胞中蛋白水平的影响

应用Western blot法检测发现，脱水穿心莲内酯可导致Ishikawa细胞中的caspase-3表达水平上调，Bcl-2的表达水平下调；且随着药物浓度的增加，这种变化愈加明显。Caspase-3水平的上调及Bcl-2蛋白水平的下调，导致了子宫内膜癌细胞的抗凋亡能力下调，即导致了细胞凋亡(P<0.05)，图3。

a.对照组;b.脱水穿心莲内酯40 μmol/L;c.脱水穿心莲内酯160 μmol/L;d.脱水穿心莲内酯320 μmol/L图 3 脱水穿心莲内酯对子宫内膜癌细胞中蛋白水平的影响

3 讨 论

炎症对肿瘤的发生及发展有促进作用，例如慢性肝炎可导致肝癌、慢性萎缩性胃炎可导致胃癌、慢性肠炎可导致肠癌等[6]，子宫内膜癌的发生也与子宫内膜的长期炎症刺激有关。炎症与肿瘤的关系提示抗炎药物有望成为抗肿瘤的新型药物。传统中药中多含有具有抗炎活力的组分，脱水穿心莲内酯即为其中之一。脱水穿心莲内酯具有较好的抗炎作用，以其为主要成分的莲必治等药物对于上呼吸道感染等炎症性疾病具有较好的疗效[5]。近年来，关于脱水穿心莲内酯的抗肿瘤活性引起了广泛关注。研究表明，脱水穿心莲内酯对人乳腺癌细胞、人肺癌细胞、人前列腺癌细胞、人结肠癌细胞等均有显著的细胞毒作用[6]。子宫内膜癌恶性度高，目前尚缺乏较有效的治疗手段。本研究以人子宫内膜癌细胞作为研究对象，检测了脱水穿心莲内酯对子宫内膜癌细胞增殖与凋亡的影响。实验表明，脱水穿心莲内酯作用24 h后，子宫内膜癌细胞开始皱缩变形，增殖率下降。说明脱水穿心莲内酯能够显著抑制子宫内膜癌细胞的增殖，且呈浓度依赖性。采用流式细胞仪检测脱水穿心莲内酯对子宫内膜癌细胞凋亡的影响，结果显示，作用24 h后，细胞凋亡率显著上升，且药物浓度越大凋亡率越高。经Western blot法检测发现，脱水穿心莲内酯可增加caspase-3表达水平，下调Bcl-2蛋白表达，可导致细胞抗凋亡能力下降，导致细胞凋亡。

综上所述，脱水穿心莲内酯可以抑制人子宫内膜癌细胞增殖，并可通过上调caspase-3及下调Bcl-2蛋白表达而增加子宫内膜癌细胞的凋亡。表明脱水穿心莲内酯具有抑制人子宫内膜癌细胞增殖、促进凋亡的作用，有望成为子宫内膜癌的新型治疗药物，具有进一步研究的价值。