薏苡仁脂肪酸的α-葡萄糖苷酶抑制活性

周丽琬，李颖，陈惠琴，杨小雨，徐幸莲*，戴好富,*

1. 南京农业大学食品科技学院（南京 210095）；2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南省黎药资源天然产物研究与利用重点实验室（海口 571101）；3. 贵州省农业科学院亚热带作物研究所（兴义 562400）

薏苡（Coix lacryma-jobiL. var. ma-yuen Stapf）为禾本科（Gramineae）薏苡属（CoixL.）一年生或多年生草本植物[1]。将壳及种皮从种子中剥离后的部分为薏仁，也被称作薏仁米、薏珠子等[2-3]。薏苡是一种药食两用的栽培作物，有丰富的营养价值以及多样的保健功能，享有“世界禾本科植物之王”的美誉[4-5]。在中国、印度、日本及越南等东南亚国家均有广泛种植[6]。

薏苡历史悠久，可作为保健品以及中成药，其味甘、淡，性凉，归脾、胃、肺经，有利水渗湿、健脾止泻、除痹、排脓、解毒散结的功效[7-9]。有关薏苡仁降血糖的功效自古即有迹可寻，《神农本草经》记载薏苡能够清热除湿、健脾润肺，因此对于消渴（糖尿病）的三多症状均有功效；《本草拾遗》中称薏苡仁可“温气、主消渴”；《本草纲目》中也有记载其可“治消渴饮水”[10]。薏苡仁作为薏苡可直接食用的一部分，国内外对其活性方面已有了较多的研究，已有研究表明薏苡仁多糖具有降血糖活性[11-13]，但对于薏苡仁的其他成分是否参与降血糖作用的研究较少。因此，研究旨在探究薏苡仁脂肪酸的降血糖活性，并以作为治疗II型糖尿病的重要靶点之一α-葡萄糖苷酶为活性筛选模型[14]，利用优化后的pNPG法对各提取物及其中的主要脂肪酸成分进行α-葡萄糖苷酶抑制活性的筛选及酶动力学测试，为薏苡仁降血糖活性的研究开阔思路与方向，同时为相关产品的开发提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 样品

薏苡仁采集于中国贵州省兴仁市潘家庄实验基地，经刘凡值研究员（单位：贵州省农业科学院亚热带作物研究所）鉴定其为禾本科（Gramineae）薏苡（Coix lacryma-jobiL. var. ma-yuen Stapf）。

1.2 标准品

顺式-油酸甲酯（纯度95%）和反式-油酸（纯度95%），购自北京百灵威科技有限公司；棕榈酸（纯度97%）和顺式-亚油酸甲酯（纯度99%），购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；顺式-亚油酸（纯度99%）。购自北京曼哈格生物科技有限公司。

1.3 仪器与设备

HP6890/5975C型 GC/MS联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；RODI-50-RE超纯水系统（北京华力航科技公司）；SynergyH1全波长多功能酶标仪（海南隽誉科技有限公司）；Delta 320-S型 pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）；EN 2062电子秤（海南隽誉科技有限公司）；1～1 000 μL移液枪（德国Eppendorf）。

1.4 试剂

阿卡波糖（Sigma Chemical）；α-葡萄糖苷酶（50 U/mg，Sigma Chemical）；对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG，上海源叶生物科技公司）；磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O，国药集团化学试剂有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 薏苡仁粗提物的气相色谱-质谱联用（GCMS）分析

1.5.1.1 样品前处理

利用常温浸提法对薏苡仁（27.7 kg）进行提取。按料液比1∶3（kg/L）用工业乙醇浸提三次，每次浸泡一周，收集滤液并浓缩得到乙醇提取物（405.1 g）。乙醇提取物用水充分溶解，依次用同等体积的石油醚、乙酸乙酯各萃取三次，浓缩后得到薏苡仁石油醚相（194.2 g）和乙酸乙酯相（15.0 g）。将乙醇粗提物、石油醚相及乙酸乙酯相用色谱甲醇溶解，经0.22 μm滤膜过滤后待测。

1.5.1.2 GC-MS分析

气相色谱条件：色谱柱为弹性石英毛细管柱-HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为He，载气流量1.0 mL/min，分流比40∶1；初始柱温为50 ℃，以5 ℃/min的速度升温到310℃，恒温时间为10 min，汽化室的温度均为250 ℃；溶剂延迟时间为3.0 min。质谱条件：电子轰击（EI）离子源；电子能量为70 eV；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；接口温度为280 ℃；发射电流为34.6 μA；倍增器电压为1 434 V；质量扫描范围为20～550m/z。质谱检索采用Wiley 275标准谱库检索（要求相似度90%以上），各组分的相对百分含量采用峰面积归一化法计算，推测出薏苡仁中主要成分。

1.5.2α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

α-葡萄糖苷酶抑制活性测定方法在Liu等[15]的基础上加以改进。

1.5.2.1 所需试剂的配制

（1）α-葡萄糖苷酶溶液的配制：准确称取2.0 mgα-葡萄糖苷酶固体（50 U/mg）溶解到1.0 mL PBS缓冲液（0.1 mol/L，pH 6.8）中得到100 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，再用PBS缓冲液稀释至0.2 U/mL。（2）pNPG的配制：准确称取7.5 mgpNPG溶解至10 mL PBS缓冲液中得到2.5 mmol/LpNPG溶液。（3）样品、阳性对照溶于DMSO中配制成相应浓度。

1.5.2.2 化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制率测定

将适宜浓度的样品与α-葡萄糖苷酶溶液混匀后加入96孔酶标板中，每孔中含有10 μL样品及100 μL酶溶液，若样品颜色较深，则需要设置一组样品的本底对照以减去样品在405 nm处的本底吸收值。以等量的DMSO代替样品加入酶溶液中作为阴性对照和空白对照，以阿卡波糖为阳性对照，将96孔板于37 ℃下温育15 min。然后，向空白对照及本底对照组中加入40 μL PBS（0.1 mol/L，pH 6.8），试验组、阴性对照及阳性对照组均加40 μL底物，并于37 ℃下温育15 min。最后用酶标仪测定在405 nm处的吸光度，记录每孔的吸光度，重复3次取平均值。

化合物对α-葡萄糖苷酶抑制活性的计算公式：抑制率=（A2-A1）/（A2-A0）×100%；样品颜色较深时的计算公式：抑制率=[A2-（A1-A1′）]/（A2-A0）×100%。

式中：A0、A1、A1′、A2分别为405 nm下测得的空白对照组、试验组、本底对照组、阴性对照组的吸光度。

1.5.2.3 化合物对α-葡萄糖苷酶的IC50值测定

按照2.2.2方法，将每个样品按梯度稀释配制成5个浓度进行α-葡萄糖苷酶抑制活性测试，计算各浓度下的抑制率并绘制化合物浓度-抑制率曲线图，计算得到样品对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度（IC50值）。

1.5.2.4 化合物对α-葡萄糖苷酶的酶动力学测试

按照2.2.2方法，将稀释的样品溶液（稀释3或4个浓度，通常选择在样品IC50值附近的浓度开始稀释）与酶溶液混匀后，分别与浓度为2.5，1.25，0.625，0 mmol/L的底物反应，在37 ℃下温育，每隔1 min测定一次其在405 nm处的吸光度，共测定15 min，重复三次试验求平均值。按Lineweaver-Burk方程作图，绘制酶抑制作用的动力学曲线，确定其抑制类型。竞争性抑制动力学方程如式（1）所示。

式中：[S]为底物质量浓度，mg/mL；[I]为抑制剂质量浓度，mg/mL；Vmax为最大速度，mL/min；Km为米氏常数，mg/mL；Ki为[EI]的解离常数，mg/mL。

2 结果与分析

2.1 GC-MS结果分析

薏苡仁乙醇粗提物、石油醚相及乙酸乙酯相粗提物均为油状物，其GC-MS离子流图和鉴定的化学成分见图1和表1。棕榈酸在乙醇粗提物、石油醚相及乙酸乙酯相中的峰面积占比分别为17.00%，21.88%和19.66%；顺式-油酸甲酯在这3个提取物中的峰面积占比分别为10.16%，50.79%和4.17%；顺式-亚油酸甲酯在这3个提取物中的峰面积占比分别为6.63%，11.36%和26.46%；顺式-亚油酸在乙醇粗提物和乙酸乙酯相中的峰面积占比为29.39%和27.40%；反式-油酸在乙醇粗提物和石油醚相中的峰面积占比分别为15.27%和9.4%。这5个化合物在乙醇粗提物、石油醚相及乙酸乙酯相中的总占比分别为78.45%，93.43%和77.69%。另外，石油醚相中还含有少量酸、酯类化合物，乙酸乙酯相中还含有少量酯、醇、烯酸以及甾醇类化合物。因此推测棕榈酸、反式-油酸、顺式-亚油酸、顺式-油酸甲酯、顺式-亚油酸甲酯为薏苡仁中主要成分。

图1 薏苡仁乙醇粗提物（a）、石油醚相（b）及乙酸乙酯相（c）的GC-MS离子流图

表1 薏苡仁乙醇粗提物、石油醚相及乙酸乙酯相中的主要成分

2.2 薏苡仁粗提物的α-葡萄糖苷酶抑制活性

薏苡仁乙醇粗提物、石油醚相及乙酸乙酯相均有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性（表2）。

表2 薏苡仁乙醇粗提物、石油醚相和乙酸乙酯相的α-葡萄糖苷酶抑制活性（n=3，x±s）

2.3 薏苡仁中主要成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性

对薏苡仁中5种主要成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性作进一步探索。5个化合物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50值见表3，对α-葡萄糖苷酶的酶动力学结果见图2。

2.3.1 主要成分的α-葡萄糖苷酶IC50值测定结果

化合物的IC50值见表3。这5个化合物对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，且都明显强于阳性对照阿卡波糖（IC50=581.94±0.26 μmol/L）。

表3 薏苡仁中主要成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性（n=3，x±s）

2.3.2 主要成分对α-葡萄糖苷酶的酶动力学测试结果

以底物质量浓度（S）的倒数与反应速率（V）的倒数作双倒数曲线图（图2）。从双倒数曲线图中可以判断化合物的抑制类型：若所有曲线（不同的抑制剂浓度）的交点在y轴上，则表明化合物为竞争性抑制剂；若在x轴上则表明化合物为非竞争性抑制剂；若交点不在坐标轴上则表明化合物为混合性抑制剂[16]。由图2可知，化合物2（图2-b）、化合物4（图2-d）和化合物5（图2-e）的双倒数图有良好的线性关系，所有曲线均相交于y轴，即随着抑制剂的质量浓度增大，Vmax不变，Km增大，说明抑制剂和pNPG在该酶（E）上的结合位点一致，因此化合物2，4和5对葡萄糖苷酶有竞争性抑制作用；而化合物1（图2-a）和3（图2-c）的双倒数曲线显示，所有曲线的交点不在坐标轴上，即随着抑制剂质量浓度的增大，Vmax减小，Km增大，说明这两个抑制剂不仅与酶结合发挥抑制作用，还会与酶-底物复合物结合抑制α-葡萄糖苷酶活性，因此这两个抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为混合性抑制。表4为各抑制剂的酶抑制常数Ki（双曲线倒数图中各曲线斜率值-抑制剂质量浓度所作曲线的x轴截距）和酶-底物络合物抑制常数Kis（双曲线倒数图中各曲线的y轴截距-抑制剂质量浓度所作曲线的x轴截距），根据这两个抑制常数可以推断出抑制剂对酶的亲和力，数值越小，抑制剂对酶的亲和力越好，结合更紧密，抑制能力越强[17-18]。由这5个化合物的Ki值可以判断它们的抑制能力由强到弱依次为反式-油酸＞亚油酸甲酯＞顺式-亚油酸＞棕榈酸＞油酸甲酯。另外，根据混合型抑制剂的Ki和Kis值可以判断抑制剂分别与酶、酶-底物复合物的亲和程度，其中化合物1表现出与酶的亲和力更好，说明抑制剂主要通过与酶结合发挥抑制作用；而化合物3则与酶-底物复合物的亲和力更好，说明化合物3主要是通过与酶-底物复合物结合发挥抑制效果。

表4 主要成分对α-葡萄糖苷酶的抑制类型及抑制常数

图2 化合物1～5对α-葡萄糖苷酶抑制活性的双倒数曲线图（a-e）

3 结论

已有文献报道薏苡仁多糖的降血糖活性，而对于薏苡仁其他成分的降血糖活性少见报道，因此本文利用pNPG法对薏苡仁进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性测试以探究其降血糖活性。经GC-MS分析发现其中的主要成分为棕榈酸、反式-油酸、顺式-亚油酸、顺式-油酸甲酯、顺式-亚油酸甲酯，对上述的5个化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性测试及酶动力学探究发现它们对α-葡萄糖苷酶的抑制作用均明显强于阳性对照阿卡波糖。酶动力学结果显示：反式-油酸、顺式-油酸甲酯和顺式-亚油酸甲酯对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为竞争性抑制，棕榈酸和顺式-亚油酸对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为混合性抑制；这5个化合物的抑制能力由强到弱依次为反式-油酸＞亚油酸甲酯＞顺式-亚油酸＞棕榈酸＞油酸甲酯。

薏苡仁中脂肪酸含量较高，且具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，为了进一步证明脂肪酸的降血糖活性，后期还需通过大量严格的体内试验、临床试验等的验证，为薏苡仁的降血糖相关产品的开发提供一定的科学依据。