那曲黄绿蜜环菌营养成分及其抗氧化性的测定与分析
2022-07-04曹叶伟扎西穷达朱肖翔王珊珊尼珍
曹叶伟，扎西穷达，朱肖翔，王珊珊，尼珍*
西藏自治区食品药品检验研究院（拉萨 850000）
黄绿蜜环菌（Armillaria luteo-virens），又名黄蘑菇、皇菇、双环菌，属于担子菌亚门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycentes）口蘑目（Tricholomatales）口蘑科（Tcholomataceae）蜜环菌属（Armillaria），主要分布于我国的西南地区，尤其是青藏高原地带，夏秋季生长在低温、高海拔的蒿草草甸或草原上，单生、散生、野生，常形成蘑菇圈[1-3]。研究发现，野生黄绿蜜环菌子实体中含有较丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、硒、糖类、生物碱、挥发油、脂肪酸和少量皂苷、强心苷、甾体三萜类、有机酸、黄酮等[4-10]，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗流感病毒，促进小儿发育等作用[11-14]。近年来的研究对象多为青海产黄绿蜜环菌，对于西藏尤其是作为特色资源的那曲黄绿蜜环菌鲜少有报道，分析那曲黄绿蜜环菌的营养成分及其抗氧化活性，以期为那曲黄绿蜜环菌的开发应用提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
黄绿蜜环菌样品（采集自西藏那曲的干燥品，均需研磨成细粉）。
1.2 仪器与试剂
Kjeltec8400全自动凯氏定氮仪（福斯）；20AT液相色谱仪（岛津）；AL204-IC天平（梅特勒）；TU-1810D紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；NexION1000电感耦合等离子体质谱仪（珀金埃尔默）；ETHOS UP微波消解仪（迈尔斯通）；CF16RXII离心机（日立）。
硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、氢氧化钠、95%乙醇、盐酸标准滴定液、三乙胺、盐酸、乙腈、异硫氰酸苯酯、衍生剂（异硫氰酸苯酯∶三乙胺∶乙腈=1∶1∶8）、蒽酮、Tris-HCl、邻苯三酚、磷酸缓冲液、过氧化氢、乙二胺四乙酸二钠、超纯水。试剂为分析纯、优级纯或色谱纯。
1.3 测定方法
1.3.1 蛋白质的测定
参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》。
1.3.2 游离氨基酸的测定
1.3.2.1 色谱条件
色谱柱Agilent extend-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相，A相为0.1 mol/L乙酸钠水溶液（醋酸调pH 5.0）；B相为乙腈；流速1.0 mL/min；柱温30℃；检测波长254 nm；进样体积20 μL；梯度洗脱程序见表1。
表1 游离氨基酸含量测定梯度洗脱程序
1.3.2.2 标准曲线的配制
配制标准溶液储备液。分别精确称取约10 mg氨基酸对照品天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及赖氨酸至25 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解并定容至刻度。
配制混合系列标准工作溶液。精密量取储备液，用0.1 mol/L盐酸溶液配制成质量浓度分别为2，5，10，20和50 μg/mL的混合系列标准工作溶液。
标准曲线见表2。
表2 氨基酸标准曲线
1.3.2.3 试样的制备与测定
称取约2.0 g样品粉末于离心管中，加入30 mL 0.1 mol/L盐酸混匀，超声30 min，过滤至50 mL比色管中，用水润洗离心管后过滤至比色管中，加水至50 mL，作为样品溶液。
取混合标准系列工作液及样品溶液各100 μL置4 mL离心管中，加入100 μL衍生试剂，涡旋20 s，放置60 min，加800 μL水、0.5 mL正己烷，涡旋1 min，静置10 min，取0.5 mL下层溶液加正己烷，涡旋1 min，静置10 min，取下层溶液，用0.22 μm滤膜过滤后取20 μL进行色谱分析，按标准曲线法计算氨基酸含量。
1.3.2.4 典型色谱图
图1 10.0 μg/mL氨基酸标准品色谱图
图2 那曲市周边样品色谱图
1.3.3 多糖的测定
1.3.3.1 试剂的配制
配制硫酸蒽酮溶液。精密称取0.1 g蒽酮，加100 mL硫酸溶液使溶解，摇匀，置于棕色瓶，即得。
1.3.3.2 对照品溶液的配制
精密称取约12 mg经98～100 ℃干燥2 h的葡萄糖标准品置100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得。
1.3.3.3 标准曲线的配制
精密量取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.5和2.0 mL对照品溶液，分别置于10 mL具塞试管中，各加水至2.0 mL，迅速加入6 mL硫酸蒽酮溶液，立即摇匀，放置15 min，立即置冰水浴中冷却15 min，取出，以相应的试剂为空白，在625 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以质量浓度（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，回归方程为f(x)=29.161x-0.021 7，R2=0.993 1。
1.3.3.4 试样的制备与测定
称取约2 g样品粉末，置圆底烧瓶中，加50 mL水，超声提取2 min，静置1 h，于80 ℃水浴加热浸提4 h，趁热过滤，用少量热水洗涤滤器和滤渣，将滤渣置圆底烧瓶中，加20 mL水，于80 ℃水浴加热浸提2 h，趁热过滤，合并滤液，于70 ℃水浴真空旋干，残渣用12 mL水溶解，边搅拌边缓慢加入38 mL乙醇，摇匀，于4 ℃放置12 h，离心，弃去上清液，沉淀用热水溶解，转移并定容至500 mL，摇匀，取2.5 mL上清液，置25 mL量瓶，加水定容至刻度，摇匀，即得。
精密量取2 mL样品溶液，置10 mL具塞试管中，照标准曲线制备显色方法，迅速加入6 mL硫酸蒽酮溶液，同法操作，测定吸光度，按标准曲线法计算多糖含量。
1.3.4 硒的测定
参照GB 5009.93—2017《食品安全国家标准 食品中硒的测定》。
1.3.5 水溶物抗氧化性测定
1.3.5.1 试样的制备
精密称取约2.0 g样品，置离心管中，加入20 mL超纯水，涡旋混匀，超声提取30 min，涡旋混匀，按3 500 r/min离心10 min，取上层清液为样品溶液。
1.3.5.2 羟基自由基抑制率测定
按顺序分别在试管中加入1 mL 0.15 mol/L、pH 7.4的磷酸缓冲液、0.5 mL样品溶液、1 mL 1.3%过氧化氢溶液（新鲜配制）和1 mL 0.95 mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（新鲜配制），混匀后置30 ℃水浴反应30 min，在550 nm波长处测定吸光度，记为A样品，以0.5 mL水代替样品溶液同法测定吸光度，记为A对照，按式（1）计算羟基自由基抑制率。
1.3.5.3 超氧阴离子自由基抑制率测定
取4.5 mL 0.05 mol/L、pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液于试管中，置25 ℃水浴预热20 min，按顺序加入0.1 mL样品溶液和0.4 mL 2.5 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后置25 ℃水浴准确反应4 min，立即加2滴中8 mol/L盐酸溶液止反应，在299 nm波长处测定吸光度，记为A样品，以0.1 mL水代替样品溶液同法测定吸光度，记为A对照，按式（2）计算超氧阴离子自由基抑制率。
2 结果与分析
2.1 蛋白质含量的分析
那曲黄绿蜜环菌中蛋白质含量为33.05～38.36 g/100 g，如表3所示，与文献[15]报道的青海黄绿蜜环菌中的蛋白质含量相当。
表3 蛋白质含量的测定
2.2 游离氨基酸含量的分析
游离氨基酸检测结果显示（表4），那曲黄绿蜜环菌中19种氨基酸种类齐全，总量为55.80～79.75 mg/g，8种人体必需氨基酸含量为16.80～30.06 mg/g。其中色氨酸、谷氨酸、精氨酸及天冬酰胺含量较高，不同来源样品氨基酸含量存在差异，检出青海黄绿蜜环菌中未检出的天冬酰胺[15-16]。
表4 游离氨基酸含量的测定
2.3 多糖含量的分析
那曲黄绿蜜环菌中多糖含量为3.56～8.12 g/100 g，如表5所示，与文献[17]报道的香菇中的多糖含量相当。
表5 多糖含量的测定
2.4 硒含量的分析
GB 28050—2011《食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则》中富含硒的要求为0.15 mg/kg以上，硒含量测定结果显示（表6），那曲黄绿蜜环菌符合该要求，为富含硒食品。与文献[18]报道的富硒黑木耳中硒的平均含量相当，高于富硒香菇中硒的平均含量。
表6 硒含量的测定
2.5 抗氧化性的分析
测试那曲周边黄绿蜜环菌样品的水溶物抗氧化性，结果见表7，羟基自由基抑制率为58.14%，抑制率优于0.03%过氧化氢标准溶液；超氧阴离子自由基抑制率为56.85%，抑制率与0.15 mg/mL维生素C标准溶液相当。
表7 抗氧化性的测定
3 结论
试验对那曲黄绿蜜环菌的主要营养成分进行检测与分析：蛋白质含量为33.05～38.36 g/100 g，与青海黄绿蜜环菌中的蛋白质含量相当；19种氨基酸种类齐全，总量为55.80～79.75 mg/g，8种人体必需氨基酸含量为16.80～30.06 mg/g，其中色氨酸、谷氨酸、精氨酸及天冬酰胺含量较高，不同来源样品氨基酸含量存在差异，检出青海黄绿蜜环菌中未检出的天冬酰胺；多糖含量为3.56～8.12 g/100 g，与香菇中的多糖含量相当；硒含量为0.57～2.53 mg/kg，符合GB 28050—2011《食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则》中富含硒的要求，可界定为富含硒食品；羟基自由基抑制率为58.14%，抑制率优于0.03%过氧化氢标准溶液，超氧阴离子自由基抑制率为56.85%，抑制率与0.15 mg/mL维生素C标准溶液相当。
结果表明，那曲黄绿蜜环菌是一种富含蛋白质，19种氨基酸种类齐全，含有多糖、硒等功能性成分，具有抗氧化活性的健康佳品。发挥特色资源优势，推广其作为健康食品的内在价值，推动那曲黄绿蜜环菌的产品深加工，无疑将产生较大的经济效益，对进一步巩固脱贫攻坚成果、助力乡村振兴具有深远意义。
