再生稻根系内生固氮菌多样性分析

董 萌，解振兴，施龙清，连 玲，张居念，姜照伟，吴春珠

（福建省农业科学院水稻研究所，福建福州350018）

内生固氮菌是指定殖在植物体内且具有联合固氮能力的固氮菌。20世纪60年代，从巴西甘蔗茎内首次分离到内生固氮菌，并证明其可为甘蔗生长提供所需的氮素。在玉米、小麦、高粱、水稻等禾本科植物体内也分离到多种内生固氮菌。从云南水稻品种楚粳27的根、茎和叶中分离到125株内生固氮菌，15株可以扩增出固氮酶基因nifH片段，11株对5种病原菌具有抑制作用，其中3株兼具固氮功能和抑菌作用［1］。在野生稻内发现的固氮菌至少有31个属74个种，具有丰富的遗传多样性［2］，在高秆野生稻中分离到43株内生固氮菌，并利用IS-PCR指纹图谱监测分析，这些内生固氮菌属于6个不同的类群［3］。从栽培稻品种的根、茎和叶内分离到376个菌株，其中234个具有固氮酶活性，通过菌液蘸根和喷雾接种，2个固氮酶活性较强的菌株均能促进水稻幼苗生长［4］。

水稻是中国重要的粮食作物。近几年再生稻种植面积不断扩大，已成为一季有余而双季不足稻区的重要种植方式。再生稻种植1次，收获2次，生命周期延长，再生季根系活力强是保证再生季稳产的基础［5］。根系微生物可以提高植物耐胁迫能力，促进水稻氮吸收利用率［6,7］。甬优2640与佳辐占是适于作再生稻种植的品种，甬优2640属于籼粳交，佳辐占属于早籼稻，两者在形态特征、再生季出芽方式上存在显著差异。本研究对2个品种不同生育期根系内生固氮菌群多样性进行分析，对2种基因型水稻根系内生固氮菌群进行比较分析。

1 材料与方法

1.1 植物材料与种植

供试水稻品种为佳辐占与甬优2640，种植于福州福建省农业科学院水稻研究所农场（119.366 E，26.013 N），播种时间为2019年3月中旬，采用人工插秧方式，育秧30 d后插秧，分别在佳辐占与甬优2640头季的幼苗期、分蘖盛期、拔节期、抽穗期和成熟期，再生季收割后13 d（再生季抽穗期）、25 d（再生季齐穂期）、60 d（再生季成熟期）取样。每个品种设置3个重复，每个重复12 m2，并设置保护行，每个重复取3株混样，共计48个样品。再生季采用高留桩处理，留桩高度30 cm。头季齐穗后18 d每667m2施促芽肥尿素7.5 kg，收获后3 d施壮苗肥尿素5 kg，再生季齐穗期施穗肥尿素7.5 kg。 收获后如遇土壤过干，则当天灌水，保持浅水层。

1.2 样品采集

在移栽后7 d取根，作为幼苗期样品，其他按再生稻生长发育时期取样（地下10 cm深度根系）。先用流水冲洗表面泥土，加入装有75%酒精的50 mL离心管中并在摇床180 r/min震荡清洗3次，然后用无菌水洗涤3～5次，接着放入20 g/L的次氯酸钠溶液中消毒10 min，无菌水冲洗3～5次。并用无菌纸吸干水分，放入-80℃保存。

1.3 nifH基因文库构建和测序

提取样品DNA，并用Nanodrop对DNA进行定量并统一稀释，使用引物nifH-F（ACCCGCCTGATCCTGCACGCCAAGG） 和nifH-R（ACGATGTAGATTTCCTGGGCCTTGTT）对内生固氮菌固氮酶铁蛋白nifH基因进行聚合美链式反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增，PCR扩增采用全式金公司的Pfu高保真DNA聚合酶，并设置阴性对照。扩增产物磁珠（Vazyme VAHTSTM DNA Clean Beads）纯化回收，并对回收产物进行荧光定量，试剂为Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量仪器为Microplate reader（BioTek，FLx800）。根据荧光定量结果，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库，采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor荧光定量系统上对文库进行定量，并使用Illumina Miseq/NovaSeq测序平台进行双端测序。

1.4 生物信息学分析

所有测序获得的nifH基因扩增子数据首先通过质量初筛去除barcode序列。通过qiime dada2 denoise-paired调用DADA2进行质控、去噪、拼接、去嵌合体。运用R3.5.1对所得的测序数据进行统计分析，并利用USEARCH进行α多样性和β多样性的参数统计分析。在α多样性分析中，利用Anova法进行整体差异分析、利用t检验方法进行组间差异分析；在β多样性研究中，基于Binary Jaccard算法进行NMDS分析；利用维恩（Venn）图展示不同生长环境间共有、特有的内生固氮菌OTU数目，直观地表现出样品间OTU的重合情况；用LEfSe ［Line DiscriminantAnalysis（LDA）Effect Size］分析寻找不同生长环境中的差异内生固氮菌。

2 结果与分析

2.1 不同品种对再生稻根系内生固氮菌多样性影响

从48个样品中通过高通量测序获得了12 604 306条高质量序列，平均每个样品262 590条，最少的只有168 298条，最多的有683 003条。用DADA2对高质量序列进行质控、去噪、拼接、去嵌合体，并对结果进行统计，如图1A所示，佳辐占与甬优2640总共获得15 942个OTUs，其中甬优2640鉴定到12 534个OTUs，佳辐占鉴定到10 388个OTUs，佳辐占与甬优2640共有6 980个OTUs，占总数的43.78%。从图1B中可以发现，在门水平上，变形菌门（Proteobacteria）是甬优2640、佳辐占和甬优2640-佳辐占共有OTUs中最多的门。从图1C可以发现，在甬优2640与佳辐占根系内慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、固氮螺菌属（Azospirillum）、脱磷弧菌属（Desulfovibrio）、中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）和固氮细菌（Azotobacter）是富集最多的内生固氮菌属，其中慢生根瘤菌属是优势菌属。

图1 甬优2640与佳辐占根系内生固氮菌OTUs数

为了比较佳辐占与甬优2640根系内生固氮菌的丰富度、多样性和覆盖度，利用α多样性指数中的Chao1、Simpson和Shannon指数进行比较分析。由图2可以看出，佳辐占与甬优2640的Chao1、Simpson和Shannon指数均达到显著差异水平（p<0.5）。

图2 甬优2640与佳辐占根系内生固氮菌α多样性指数

2.2 不同生育期对再生稻根系内生固氮菌多样性影响

对甬优2640和佳辐占不同生育期根系内生固氮菌群进行分析，由图3A可见，慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、固氮螺菌属（Azospirillum）、中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）、甲基孢囊菌属（Methylocystis）和弗兰克氏菌属（Frankia），其慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）和固氮螺菌属（Azospirillum）在再生稻的不同生育期都是优势菌属。在再生稻头季的齐穗期和成熟期内生固氮菌相对丰度最高，在再生季收割后25 d内生固氮菌群相对丰度达到最高，然后再生季成熟期相对丰度降低。

我们利用Jaccard距离来计算不同生育期内生固氮菌群的β-多样性，非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling, NMDS）通过对样本距离进行等级排序。由图3B可以看出，甬优2640与佳辐占在不同生育期内生固氮菌群沿MDS1排列，从图中可以看出随着水稻生育期的变化，内生固氮菌群多样性发生变化，进一步表明随着水稻生长发育，根系内的内生固氮菌群结构发生显著差异（Stress=0.147）。

图3 不同生育期根系内生固氮菌多样性

为了进一步比较水稻不同生育期内生固氮菌群的物种组成差异，使用属水平单元作为分析对象，对平均丰度前50位的属进行热土绘制（图4）。如图4所示，随着水稻生育期变化，根系内生固氮菌群丰度发生变化，在苗期以Methylomonas、Pseudomonas、Enterobacter、Azovibrio、Pelomonas、Xanthobacter、Pseudacidovorax、Dechloromonas、Rhizobium、Zoogloea、Azonexus、Ralstonia、Rhodopseudomonas属富集最多，分蘖期以Desulfobulbus、Azohydromonas、Arthrobacter、Aquaspirillum、Anaeromyxobacter、Azotobacter、Magnetospirillum、Pseudodesulfovibrio、Syntrophobacter、Vitreoscilla、Sideroxydans属富集最多，而内生固氮菌多样性对丰富的齐穗期以Methylomusa、Methylosinus、Azospira、Halomonas、Klebsiella属富集最多，成熟期以Pleomorphomonas、Methylocystis属富集最多，头季收割后富集的内生固氮菌群也发生了变化，与再生稻头季齐穗期与成熟期富集的内生固氮菌群不同。

图4 不同生育期内生固氮菌群热图

2.3 根系内生固氮菌群微生物标志物

根据线性判别分析效应量（Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）计算再生稻不同生育期根系内生固氮菌群为生物标志物，并将其在分类学分支图上的位置进行标记（图5A）。由图5可见，再生稻头季苗期有8个类群，分别为变形菌门、红环菌目（Rhodocyclales）、丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）、γ- 变形菌纲（Gammaproteobacteria）、脱氯单胞菌属（Dechloromonas）、嗜糖假单胞菌属（Pelomonas）、假单胞菌目（Pseudomonadales）和假单胞菌科（Pseudomonadaceae），头季分蘖期有2个根瘤菌科（Rhizobiaceae）和假脱硫弧菌属（Pseudodesulfovibrio），头季拔节期2个分别为固氮螺菌属（Azospirillum）和红螺菌目（Rhodospirillales），头季齐穗期2个分别为中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）和甲基弯曲菌属（Methylosinus），头季成熟期2个分别为慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）和多形单胞菌属（Pleomorphomonas），头季收割后13 d只有一个，是伯克氏菌科（Burkholderiaceae），头季收割后25 d有3个分别为放线菌门（Actinobacteria）、地杆菌属（Geobacter）和帕拉伯克霍尔德属（Paraburkholderia），头季收割后60 d有4个，分别为α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、根瘤菌目（Rhizobiales）、Pseudolabrys属和Zoogloeaceae属。

图5 再生稻不同生育期根系微生物组线性判别分析效应量

3 讨论

植物内生固氮菌自首次从甘蔗中发现以来，研究人员对于水稻的内生固氮菌也进行了研究，在水稻栽培品种中分离并鉴定了内生固氮菌，并研究了黄酮类化合物和生长素对内生固氮菌在水稻中定殖的影响，并通过DNA指纹图谱分析划分为多个类群［8，9］。在普通野生稻中，分离到37株内生固氮菌，并通过16S rRNA将这些内生固氮菌分为多个类群，表明普通野生稻内生固氮菌具有较大多样性，且具有高固氮酶活性，能明显促进水稻生长［10］。本研究对甬优2640与佳辐占2个再生稻品种不同生育期根系内生固氮菌进行鉴定，发现甬优2640与佳辐占内生固氮菌以慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）与固氮螺菌属（Azospirillum）为优势菌群，都属于α-变形菌纲，与野生稻的内生固氮菌群存在差异。佳辐占与甬优2640两个水稻品种的基因型差异较大，内生固氮菌多样性也存在较大差异，与文献报道结果一致［11,12］。

在甬优2640与佳辐占不同生育期根系的内生固氮菌群进行分析，发现内生固氮菌群多样性随着水稻生长发育发生变化，与前人研究结果一致，在水稻生长发育过程中根系微生物菌群多样性会发生动态变化［11-13］。本研究以再生稻为研究材料，发现慢生根瘤菌在再生稻的不同生育期相对丰度最高，前人研究也从水稻中分离到慢生根瘤菌株，且泰国慢生根瘤菌群比日本慢生根瘤菌群更能促进泰国水稻品种的生长［14，15］。通过对不同生育期内生固氮菌群进行线性判别分析效应量分析，鉴定出不同生育期的标志微生物，这些微生物的变化可能与水稻生长发育等生命活动相关。因此，深入挖掘不同生育期内生固氮菌群的潜在功能，进而探究再生稻根系不同生育期的内生固氮菌群如何作用于水稻生长发育进而产生调控作用。本研究结果反映了再生稻不同品种及不同生育期根系内生固氮菌群多样性差异，为减少水稻化肥施用和水稻菌肥发展提供理论基础。