水培蕹菜使用吡唑醚菌酯的水生生态系统风险评估

2022-07-04宋雯王强张怡徐明飞陈丽萍苍涛吴长兴

农业环境科学学报 2022年6期

宋雯，王强，张怡，徐明飞，陈丽萍，苍涛，吴长兴

（农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（杭州），浙江省农药残留检测与控制研究重点实验室，浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所，杭州 310021）

蕹菜（Forsk）茎圆而中空，又名空心菜，绿叶和嫩茎可供食用，具有清热解毒、凉血利尿、促进食欲等功效。蕹菜耐高温、耐贫瘠，根茎有很强的再生能力，是长江以南地区夏秋季普遍栽培的重要“保淡”蔬菜之一。蕹菜在土壤和水中都可以栽培，尤以水培品质佳、产量高。近年来，研究已明确了水培蕹菜对富营养化水体中氮磷的高效吸纳去除效果，其在水体生态修复中的应用已屡见不鲜，如用于罗非鱼、鲤鱼、龟鳖等养殖池塘的水体净化。

蕹菜喜高温多湿环境，易感白锈病、褐斑病和叶斑病等病害。目前，我国仅批准登记了嘧菌酯1 种农药用于防治蕹菜白锈病。但在蕹菜病害的防治研究和实践中，吡唑醚菌酯因其优异的杀菌防治谱和防效，以及植物健康作用，而常被列为推荐用药。2019—2020年，本研究团队在福建省、广西省和浙江省抽样检测了66份水培蕹菜样品，其中43.9%的样品检出吡唑醚菌酯残留，残留量为0.000 2～0.568 0 mg·kg。

吡唑醚菌酯是一种兼具吡唑结构的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，其化合物对鸟类、蜜蜂和蚯蚓低毒，但对水生生物毒性极高。欧盟评估报告强调，使用该农药需特别注意对水生生物，尤其是对鱼的保护。考虑到吡唑醚菌酯对水生生物的毒性和其在水培蕹菜上残留的检出情况，水培蕹菜上使用的吡唑醚菌酯是否会进入水体，及其是否会对水生生态系统造成影响，成为值得关注的问题。

在我国，吡唑醚菌酯制剂产品绝大部分登记在旱地作物上（黄瓜、番茄、香蕉、葡萄、小麦和玉米等），以悬浮剂（Suspension concentrate，SC）为主，约占登记总量的60%。仅有5个登记于水稻的吡唑醚菌酯制剂产品，分别是1个种子处理悬浮剂和4个微囊悬浮剂（Microcapsule suspension，CS）。微囊悬浮剂是巴斯夫欧洲公司开发出专用于稻田的吡唑醚菌酯剂型，其使用时必须确保稻田无水或稻田水深在1 cm 以下。关于吡唑醚菌酯对斑马鱼、大型溞、非洲瓜蟾蝌蚪等模式水生生物影响的研究表明，加工成微胶囊后，吡唑醚菌酯对部分水生生物的毒性有所降低。目前，水生蔬菜使用吡唑醚菌酯对水生生态系统的影响，以及微囊悬浮剂与传统悬浮剂的风险差异还未见文献报道。鉴于此，本研究以吡唑醚菌酯微囊悬浮剂和悬浮剂为对象，研究其施用后在水培蕹菜和水体中的残留水平，并评估其对水生生态系统的风险，为在水培蕹菜乃至水生蔬菜上的合理用药提供参考，并为制定吡唑醚菌酯的最大残留限量标准提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试蔬菜：泰国柳叶空心菜。

供试药剂：9% 吡唑醚菌酯CS（巴斯夫欧洲公司）和25%吡唑醚菌酯SC（浙江天一生物科技有限公司）。

供试仪器：ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S micro液相色谱-串联质谱联用仪（美国沃特世公司）；BSA2202S 电子天平，精确至0.01 g（德国赛多利斯公司）；BSA224S电子天平，精确至0.1 mg（德国赛多利斯公司）；T18 高速组织匀浆机（德国IKA）；Lab dancer S25 漩涡振荡器（德国IKA）；R215 旋转蒸发仪（瑞士步琦公司）；CT15RE 小型台式冷冻离心机（日本日立公司）；ST16R 高速冷冻离心机（美国赛默飞世尔科技有限公司）；Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪（睿科仪器有限公司）。

供试试剂：吡唑醚菌酯标准品，浓度999.3 μg·mL（北京振翔科技有限公司）；乙腈和甲苯，色谱纯（美国赛默飞世尔科技有限公司）；无水硫酸钠、氯化钠和无水硫酸镁（上海凌峰化学试剂有限公司）；C18和N-丙基乙二胺（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；氨基固相萃取柱，500 mg，6 mL（天津博纳艾杰尔科技有限公司）。

1.2 田间试验设计

试验于2020年7 月在浙江省绍兴市越城区马山镇车一村绿岛蔬菜专业合作社的水蕹菜种植区进行。试验设2个供试药剂处理和1个空白对照，每个处理重复3 次。每个小区面积约45 m，小区间设置隔离带，水域不联通，避免污染。

供试药剂于水培蕹菜白锈病发病初期施用，茎叶喷雾，施药1次。依据调研信息，施药剂量按风险最大化原则，供试药剂参考9%吡唑醚菌酯CS在水稻上推荐的最高剂量（有效成分用量98.6 g·hm）施用。用水量为750 L·hm。空白对照小区喷清水。分别于施药后2 h及第1、2、3、5、7、10、14、18、23、28天采集水培蕹菜样品；于施药后2 h及第2、5、10、14、18、28天采集水样。按对角线法采样，水培蕹菜样品切碎并充分混匀后四分法留样200 g。所有样品于-20 ℃保存待测。

1.3 残留量分析方法

1.3.1 样品前处理

称取20 g 水培蕹菜于100 mL 匀浆杯中，加入40 mL 乙腈，混匀提取1 min。然后再加入5 g 氯化钠，涡旋提取1 min，抽滤，取滤液20 mL。滤液在40 ℃水浴中旋转浓缩至约1 mL，待净化。加入约2 cm 无水硫酸钠至净化柱（氨基固相萃取柱），并用4.0 mL乙腈、甲苯混合液（∶=3∶1）预洗柱。将样品浓缩液加至净化柱上，然后用31 mL 乙腈、甲苯混合液（∶=3∶1）淋洗净化柱。淋洗液在40 ℃水浴条件下旋转浓缩至0.5 mL，氮吹吹干后，迅速加入10 mL 的乙腈、水混合液（∶=3∶2）涡旋 3 0 s，经 0 .22 μm 滤膜过滤后，待测。

称取10 mL 水样于50 mL 离心管中，加入10 mL乙腈，振荡30 min。再加入5 g 氯化钠，振荡1 min。然后在8 000 r·min转速下离心3 min，吸取1.5 mL上清液待净化。称取 1 50 mg MgSO、50 mg C18、50 mg N-丙基乙二胺于2 mL 离心管中，然后加入1.5 mL 上清液，离心管涡旋1 min、12 000 r·min离心3 min 后，取上清液并过0.22 μm滤膜，待测。

1.3.2 仪器测定条件

吡唑醚菌酯残留量采用液相色谱-串联质谱联用仪测定。色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱：硅胶键合 C 18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）。流动相 A 为 0 .1% 甲酸乙腈溶液，B 为水，A∶B 为 8∶ 2。等度洗脱，流速0.25 mL·min，洗脱时间3 min。柱温40 ℃，进样体积2.0 μL。正离子电离（ESI+），采用MRM 多反应监测。喷针电压3.0 kV，离子源温度150 ℃。脱溶剂温度500 ℃，脱溶剂气流量800 L·h，锥孔反吹气流量50 L·h。吡唑醚菌酯定量离子对为388.1＞193.9，锥孔电压5 V，碰撞能量12 V；定性离子对为388.1＞163.0，锥孔电压5 V，碰撞能量25 V。

1.3.3 标准溶液配制及标准曲线绘制

利用乙腈作为溶剂，将吡唑醚菌酯标准品稀释为0.03、0.5、1.0、1.5、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg·L的系列标准工作液。按1.3.2. 中的条件测定，以进样浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。外标法定量。

1.3.4 添加回收试验

分别向空白水培蕹菜样品、空白水样品中添加吡唑醚菌酯标准工作溶液。水培蕹菜的添加水平为1.3、2.6、13.0 μg·kg，水的添加水平为 0 .13、0.26、1.30 μg·L，每个水平重复6次。

1.4 水生生态系统风险评估

欧洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）对吡唑醚菌酯及其代谢物的环境行为和对非靶标生物的影响研究表明：在水生生态系统中，吡唑醚菌酯不易被生物降解，其代谢产物对鱼、溞、藻、摇蚊的风险可接受。因此本文仅考虑吡唑醚菌酯母体对水生生态系统的影响，不评估其代谢物的风险。根据《农药登记环境风险评估指南第2 部分：水生生态系统》（NY/T 2882.2—2016），对水生生态系统风险进行评估。

1.4.1 暴露分析

本文构建了水培蕹菜-地表水暴露场景，地表水中吡唑醚菌酯残留主要源于水培蕹菜病害防治时的喷雾。施药时，水培蕹菜叶片覆盖率为70%～90%。

根据剂型性质确定环境浓度（Environmental concentration）值。以水中吡唑醚菌酯的实测浓度作为25% 吡唑醚菌酯SC在水中暴露的环境浓度。依据9% 吡唑醚菌酯CS 在水-沉积物系统中的行为数据（入水24 h 内近80% 被胶囊包裹的吡唑醚菌酯沉降到沉积物中，且随时间推移，游离的吡唑醚菌酯量不增加），基于风险最大化原则，以水中吡唑醚菌酯总态实测浓度的20%（游离态浓度）作为其在水中暴露的环境浓度。

首先选用环境浓度峰值进行暴露分析。若存在风险，则进一步按公式（1）通过实测暴露浓度计算时间加权平均浓度（Time-weighted mean concentration）值，其覆盖的时间范围应小于或等于相关关键毒性测试时间。观察日水中未检出残留量的以检出限（Limit of detection，LOD）计。

式中：为实测暴露浓度，μg·L；为时间间隔，d；为取样次数，取值为1、2、……、。

1.4.2 效应分析

采用生态毒理学研究得出的毒性终点值及相应的不确定性因子，按公式（2）计算预测无效应浓度。

式中：（Predicted no effect concentration）为预测无效应浓度，μg·L（以有效成分计）；（End point）为试验终点，μg·L；（Uncertainty factor）为不确定性因子。和的取值原则见NY/T 2882.2—2016。

毒性终点数据来源于EFSA 报告中对吡唑醚菌酯有效成分的生态毒理学研究，物种选择兼顾我国淡水水生生物代表性和数据可获得性。EFSA的评估报告中有8 种鱼的急性毒性终点，通过物种敏感性分布（Species sensitivity distribution，SSD）分析，获得5%物种危害浓度（Hazardous concentration for 5% of the species，HC）作为急性毒性评估终点值。上述分析采用ETX 2.0（RIVM，2004）。

1.4.3 风险表征

在获得环境浓度和效应分析结果后，用风险商值表征吡唑醚菌酯在水培蕹菜上喷施后地表水的环境风险。按公式（3）计算风险商值。

式中：（Risk quotient）为风险商值；取值可为和，μg·L（以有效成分计）。

≤1，风险可接受；＞1，风险不可接受。

2 结果与分析

2.1 检测方法的准确度、精密度和检出限

以进样浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，外标法定量。结果表明，在0.03～2.0 μg·L和1.0～20.0 μg·L范围内，吡唑醚菌酯的质量浓度与对应的峰面积间均具有良好的线性关系。经最小二乘法拟合得到标准曲线，水培蕹菜和水的回归方程分别为=10 344.9+4 436.9（=0.998 6）、=36 378.4+780.914（=0.998 9）。

添加回收试验结果（表1）表明：在1.3、2.6 μg·kg和13.0 μg·kg3个添加水平下，水培蕹菜中吡唑醚菌酯的回收率为98.2%～109.0%，相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD）为 0 .7%～3.8%；在0.13、0.26 μg·L和1.30 μg·L3个添加水平下，水中吡唑醚菌酯的回收率为84.7%～101.0%，RSD 为0.6%～1.7%。表明本方法的准确度和精密度均较好，稳定可靠。

表1 水培蕹菜和水中吡唑醚菌酯的添加回收率和相对标准偏差（n=6）Table 1 Recovery rates and RSDs of pyraclostrobin in the water spinach（Ipomoea aquatic Forsk）and water（n=6）

以3 倍信噪比计算吡唑醚菌酯的LOD，水培蕹菜中吡唑醚菌酯的LOD 为21.20 ng·kg，水中吡唑醚菌酯的LOD 为3.66 ng·L。以10 倍信噪比计算目标化合物的定量限（Limit of quantification，LOQ），水培蕹菜中吡唑醚菌酯的LOQ 为70.66 ng·kg，水中吡唑醚菌酯的LOQ 为12.19 ng·L。由此可见，本方法的检出限和定量限均可满足分析需要。

2.2 吡唑醚菌酯在水培蕹菜和水中的残留分析

吡唑醚菌酯在水培蕹菜中的消解动态见图1。25% 吡唑醚菌酯SC 在水培蕹菜中的原始沉积量为4.80 mg·kg，施药后5 d 降解至1.70 mg·kg，降解了64.6%；9% 吡唑醚菌酯CS 在水培蕹菜中的原始沉积量为 4 .02 mg·kg，5 d 时降解至1.06 mg·kg，降解了73.6%，表明两种剂型在水培蕹菜中的消解半衰期都小于5 d。吡唑醚菌酯在水培蕹菜中的消解符合一级反应动力学方程，25% 吡唑醚菌酯SC 的消解曲线为C=4.502e（R=0.954 2），消解半衰期为2.9 d；9%吡唑醚菌酯CS 的消解曲线为C=3.350 4e（R=0.958 4），消解半衰期为3.9 d。

图1 吡唑醚菌酯在水培蕹菜中的消解动态Figure 1 The dissipation kinetics of pyraclostrobin in the water spinach（Ipomoea aquatic Forsk）

由图1可见，施药后2 h和1、3、5 d内，25%吡唑醚菌酯SC处理在水培蕹菜中的沉积量均大于9%吡唑醚菌酯CS 处理，施药7 d 后呈相反趋势。药后28 d，9%吡唑醚菌酯CS 处理的残留量为0.046 mg·kg，高于25% 吡唑醚菌酯SC 处理约2 倍（0.015 mg·kg），表明9% 吡唑醚菌酯CS 相较于25% 吡唑醚菌酯SC 有更长的持效期，这与微囊悬浮剂的缓释特性相符。

吡唑醚菌酯在水中的残留测定结果见表2。施药后 2 h，25% 吡唑醚菌酯 S C 的浓度达 2 6.03 μg·L；9% 吡唑醚菌酯CS 在水体中的总态浓度为29.98 μg·L，游离态浓度为6.00 μg·L。施药后2 d，25% 吡唑醚菌酯SC 的浓度降解至1.65 μg·L，消散了93.7%；9% 吡唑醚菌酯 C S 总态浓度降解至 1 .05 μg·L，游离态浓度为0.21 μg·L，消散了96.5%。结果表明两种剂型的吡唑醚菌酯在水中均降解迅速，消解半衰期都小于2 d。施药后28 d，水中吡唑醚菌酯的浓度已低于LOD。9% 吡唑醚菌酯CS 处理在水中游离态浓度明显低于25%吡唑醚菌酯SC处理浓度。

表2 吡唑醚菌酯在水中的残留量（μg·L-1）Table 2 The residual amount of pyraclostrobin in the water（μg·L-1）

上述结果表明，吡唑醚菌酯在水培蕹菜中的原始沉积量大于在水中的原始沉积量，这主要是因为水培蕹菜叶片有较大的表面积，施药时能够附着较多的农药。此外，吡唑醚菌酯在水培蕹菜中的消解半衰期长于在水中的消解半衰期。

2.3 水生生态风险评估

2.3.1 暴露分析

由表2可知，25%吡唑醚菌酯SC和9%吡唑醚菌酯CS的均在施药后2 h测得，分别为26.03 μg·L和6.00 μg·L。按公式（1）计算2、18 d和28 d 3个时段的，分别对应毒性测试时段2～4、21 d 和28 d。28 d时水中的残留量以LOD 计。计算得到25% 吡唑醚菌酯SC的2、18 d和28 d的分别为8.84、1.85 μg·L和 1 .21 μg·L；9% 吡唑醚菌酯 C S 的 2 、18 d 和 2 8 d 的分别为1.73、0.37 μg·L和0.25 μg·L。

2.3.2 效应分析

吡唑醚菌酯对不同类别水生生物的效应分析见表3。急性毒性包括脊椎动物和无脊椎动物两大类生物；慢性毒性包括脊椎动物、无脊椎动物和初级生产者三大类生物。效应分析结果表明，对吡唑醚菌酯毒性最敏感的水生生物是脊椎动物（鱼）和无脊椎动物（大型溞）。

表3 吡唑醚菌酯对水生生态系统的效应分析Table 3 Analysis of the effects of the active substance pyraclostrobin on aquatic ecosystem

2.3.3 风险评估

基于分析吡唑醚菌酯对水生生物的急性、慢性风险，结果见表4。可以明显看出，两种剂型对水生脊椎动物急性与慢性、无脊椎动物急性与慢性和初级生产者慢性的风险商值均远大于1，即水生生态系统风险不可接受。其中，风险商值最大的是无脊椎动物的急性风险，其次为脊椎动物的慢性风险，最小的是初级生产者的慢性风险。

表4 基于ECmax的吡唑醚菌酯对水生生物的风险商Table 4 Risk quotient of pyraclostrobin on aquatic organisms based on ECmax

就剂型差异而言，9% 吡唑醚菌酯CS 对每一类水生生物的急性和慢性风险商值均低于25% 吡唑醚菌酯SC，说明通过减少水中游离吡唑醚菌酯含量能减少其对水生生物的毒性，但基于得到的9% 吡唑醚菌酯CS 对水生生物的急性和慢性风险商值仍在1.9～38.2之间。

基于分析得到的对水生生物的急性和慢性风险商值均大于1，因此进一步通过进行风险评价，结果见表5。由表5可知，两种剂型对水生生物的急性、慢性风险商都较评价结果有所下降。其中，25% 吡唑醚菌酯SC 对水生生物的急性和慢性风险商值，以及9%吡唑醚菌酯CS对水生生物的急性风险商值依然大于1，风险不可接受。仅9% 吡唑醚菌酯CS 对水生生物的慢性风险商值介于0.6～0.9 之间，小于1，风险可接受。

表5 基于ECtwm的吡唑醚菌酯对水生生物的风险商Table 5 Risk quotient of pyraclostrobin on aquatic organisms based on ECtwm

3 讨论

生态环境中的农药残留及潜在影响正日渐成为监测和研究的热点。吡唑醚菌酯在全球广泛应用，由于其有效成分对水生生物毒性较高，其在水体中的残留量一直广受关注。PEREZ-RODRÍGUEZ 等在丹麦葡萄果园收集检测了降水，结果表明冲刷叶片后，径流中的吡唑醚菌酯浓度为0.05～17.40 mg·L。REILLY 等对美国3个州地表水和地下水的监测表明，在土豆生长期使用吡唑醚菌酯，种植地周边的地表水吡唑醚菌酯残留检出率为42%，最高值达239.0 ng·L，地下水吡唑醚菌酯残留检出率为33%，最高值为4.8 ng·L。这些针对旱地作物的研究表明，通过径流吡唑醚菌酯确实会存在于周边的水体环境中。相比于旱地作物，在水田，特别是与水域联通的水田中，吡唑醚菌酯对水生生态系统有着更为直接的影响。由于国内外都没有批准吡唑醚菌酯在水生蔬菜上使用，因此未能查询到吡唑醚菌酯在水生蔬菜上使用后水体中的残留情况。目前，仅有吡唑醚菌酯微囊悬浮剂首先登记在中国稻田无水或水深在1 cm 以下使用，GUO等的研究表明中国稻田使用吡唑醚菌酯微囊悬浮剂后，稻田水中总态的初始沉积量最高可达29.27 μg·L，这与本研究获得的吡唑醚菌酯在水培蕹菜上使用后水中的初始沉积量相近。可见，吡唑醚菌酯在水田使用后水中的残留量远大于旱地。

就剂型特点而言，吡唑醚菌酯微囊悬浮剂在水培蕹菜上的持效期更长，进入水中的有效浓度降低，相较于常规的悬浮剂对水生生物的毒性有所降低。根据本研究风险评估结果，在水培蕹菜上使用吡唑醚菌酯悬浮剂对水生生态系统存在着不可接受的急性、慢性暴露风险，微囊悬浮剂对水生生态系统的急性暴露风险也不可接受。值得注意的是，微囊悬浮剂入水后快速沉入底泥中缓慢释放，其对我国底栖生物的影响还不甚明确。因此，依本文研究和现有的文献报道推测吡唑醚菌酯在水培蕹菜，乃至水生蔬菜上的使用可能对水体带来极大的暴露风险。目前，以水培蕹菜为代表的水生蔬菜正越来越多地被用作养殖池塘等水体水质净化的生物载体。因此，为保障水生生态系统安全，建议禁止吡唑醚菌酯在水生蔬菜上使用，尤其是鱼菜共生综合种养池塘，以及禁止在水产养殖区、河塘等水体附近使用。

我国尚未制定吡唑醚菌酯在水培蕹菜上的最大残留限量。近日实施的GB 2763—2021 中新增了吡唑醚菌酯在两种水生蔬菜（水芹和豆瓣菜）上的最大残留限量（Maximum residue limits，MRL），分别为30 mg·kg和7 mg·kg。目前，欧盟将吡唑醚菌酯的水生急性、慢性毒性都定为I 类（剧毒），以检测方法的LOD 规定了豆瓣菜中吡唑醚菌酯的MRL（0.02 mg·kg），其他水生蔬菜无MRL 规定。美国在规定绿叶蔬菜中吡唑醚菌酯的MRL 时，特别注明了不包括豆瓣菜。日本尚未有相关MRL规定。相比而言，考虑到吡唑醚菌酯的水生毒性，国际标准对水生蔬菜中吡唑醚菌酯MRL 的规定，对水生生态系统的潜在保护水平更高。参考我国在豆瓣菜上的MRL，本研究团队检测的66份水培蕹菜样品中无样品残留超标；参考欧盟在豆瓣菜上的MRL，有7.6%的样品吡唑醚菌酯残留超标。本试验条件下的水培蕹菜在施药后2 h 的残留量参考我国在豆瓣菜上的MRL，也未超标，但在此施药量下对水生生态系统的急性暴露风险已不可接受。本研究推测GB 2763—2021 的相关规定可能仅考虑了残留的膳食风险，而未考虑环境风险，因此相对宽松。建议充分考虑吡唑醚菌酯对水生生物的风险，修订其在水生蔬菜上的最大残留限量标准，实施针对性监测，开展科学有效的监管。

本研究基于水培蕹菜施药后水中残留的和对吡唑醚菌酯悬浮剂和微囊悬浮剂进行水生生态风险评价时，存在几点不确定因素：①吡唑醚菌酯微囊悬浮剂游离态浓度依据该制剂环境行为研究推算，未实测获得；②本研究的水生物种及其毒性终点数据来源于EFSA，虽然选择时尽量考虑了我国水生生物分布，但敏感生物种类客观上存在一定差异，物种的选择会直接影响的计算结果；③在真实场景中对水培蕹菜喷雾施药，药后水域中的残留量受作物拦截、降水冲刷等影响。为得到更准确的评估结果，各国通常会针对本国不同施药场景、暴露方式、气候条件和水文地质环境，构建相应的数学模型来计算农药暴露量。我国现有可预测农药北方旱田地下水环境暴露的China-PEARL 模型、预测农药南方水稻田地表水和地下水环境暴露的TOP-RICE 模型，以及预测农药旱田地表水环境暴露的China-PSEM 模型，但尚无适用于本研究场景的模型。受条件所限，本次评价以水田中残留量得出的暴露风险偏保守，存在一定的局限性，更准确的评价需进一步研发高级风险评估模型或开展典型场景监测试验，评估范围宜从田间扩展至周边水域。