恒温扩增技术在儿童下呼吸道感染中的临床应用

韩 磊，牛旭东，樊瑞军

下呼吸道感染是常见的感染性疾病，是导致全世界儿童死亡的主要原因之一[1]，及时准确的诊断与有效抗感染治疗是降低死亡率的关键。儿童下呼吸道感染多有合并其他病原体混合感染[2]，且病原谱不断发生变化，病原体复杂、多样[3]，对传统的病原学检测手段也提出了挑战。恒温扩增芯片法是采用环引物介导恒温扩增技术(LAMP)原理，对下呼吸道病原菌，包括细菌、病毒、真菌等一系列病原微生物进行快速检测[4]。本研究利用恒温扩增芯片技术对疑似下呼吸道感染的儿童进行病原学鉴定，同时与传统病原学培养法进行对比，比较两种检测手段的检出率及准确性，并分析银川市内常见儿童下呼吸道感染的病原分布情况，旨在为快速诊疗儿童下呼吸道感染提供更加可靠的实验室诊断依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取2020年11月至2021年4月在银川市妇幼保健院普儿科就诊的儿童患者300例。纳入标准：符合下呼吸道感染的诊断标准[5]。排除标准：资料不全，免疫缺陷病或使用免疫抑制剂、先天性心脏病、先天性气管、支气管及肺发育不良的患儿。本研究经我院医学伦理委员会批准，并取得入组患儿法定监护人知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集：采集患儿的深部痰液标本，小月龄或无法自主咳痰的患儿采集咽部吸取痰标本，置于一次性无菌痰盒中，样本量不少于0.6 mL，视检无明显泡沫、口水及食物残渣即符合检验要求。

1.2.2 恒温扩增快速核酸检测：采用呼吸道病原菌核酸检测试剂盒(恒温扩增芯片法)及RTisochipTM-A恒温扩增芯片核酸分析仪(北京博奥生物集团有限公司)进行病原菌核酸检测。该方法采用微流控芯片与恒温扩增技术原理[4]，一步完成对靶基因的扩增和检测。本方法一次性检测13 种常见下呼吸道病原菌。

1.2.3 传统培养法： 对合格痰液样本分别接种于血平板、加万古霉素巧克力平板、麦康凯平板和罗氏培养基，于35℃、5% CO2条件培养，观察培养基并筛选可能的致病菌进行鉴定。该方法涉及的试剂和材料以及全自动微生物鉴定仪( VIT-EK2-Compact) 均购自法国梅里埃生物公司。

1.3 统计学方法：采用SPSS 22.0统计软件，采用Kappa分析一致性，当Kappa>0.4时，表明检验结果具有一致性。

2 结果

2.1 样本一般情况:本研究共纳入儿童下呼吸道感染的痰液样本300例，患儿年龄从龄1月龄～13岁，其中男176例(58.67%)，女124例(41.33%)。患儿入院主诉均为肺炎、支气管炎、毛细支气管炎、发热待查、惊厥原因待查、支气管哮喘等常见下呼吸道感染性疾病。

2.2 恒温扩增法与培养法对下呼吸道常见病原体检出情况结果比较:300例痰液样本中，恒温扩增法阳性检出率为75.00%，传统培养法阳性检出率为22.33%。两种方法同时检测为阳性的样本59例，同时检测为阴性的样本64例；本研究针对这两种病原菌检测方法进行Kappa一致性分析，结果显示P<0.05，且Kappa值<0.4时，表明两种检验结果不具有一致性，见表1。

表1 恒温扩增法与培养法对下呼吸道常见病原体检出情况结果比较

2.3 恒温扩增法对下呼吸道感染常见病原体的检出情况:恒温扩增法检出的225例呼吸道病原体中，单一病原体感染样本114例(50.67%)，其中流血嗜血杆菌的单一感染最为常见，占全部单一感染样本的30.70%；混合感染样本111例(49.33%)，其中流血嗜血杆菌(69.02%)、肺炎链球菌(72.91%)、金黄色葡萄球菌(71.43%)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(82.35%)、肺炎克雷伯菌(87.5%)多以混合感染形式出现。225例阳性标本中检出10种共365株呼吸道病原体，其中各病原体检出占比前三位的分别为流感嗜血杆菌占30.79%、肺炎链球菌占26.16%、肺炎支原体占12.53%。本次样本中未检出肺炎衣原体、嗜肺军团菌和结核分枝杆菌复合菌群，见表2。

表2 恒温扩增法对下呼吸道感染常见病原体的检出情况[n(%)]

2.4 细菌培养法对下呼吸道感染常见病原体的检出情况:传统培养法检出的67例标本中，单种病原感染样本63例(94.03%)，混合感染样本4例(5.97%)，包括2例肺炎克雷伯与其他病原菌的混合感染，1例肺炎链球菌与大肠埃希菌的混合感染以及1例流感嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌的混合感染。67例阳性标本中共检出10种71株常见的病原体，其中检出率占比前三位的分别为：肺炎克雷伯(21.13%)、肺炎链球菌(19.72%)、大肠埃希菌(15.49%)，见表3。

表3 细菌培养法对下呼吸道感染常见病原体的检出情况[n(%)]

3 讨论

恒温扩增技术针对特定病菌的靶基因位点合成特异性的引物进行DNA扩增，即使少量病菌存在也能测定。本研究结果显示，恒温扩增法的阳性检出率远高于培养法，与赵溜、吴晓睛等[6-7]研究结果一致。本研究300例样本中，恒温扩增法与培养法检出结果不具有一致性，其原因可能是两种检测方法检测范围不同所导致，恒温扩增法检测出的阳性样本数比培养法多161例，其中包含46例肺炎支原体，培养法不能检测支原体；而培养法检测为阳性、恒温扩增法为阴性的样本有8例，其中产气肠杆菌和阴沟肠杆菌是恒温扩增法里没有包含的指标。李松等人研究发现，恒温扩增法与培养法在对机械通气新生儿下呼吸道病原菌检测时一致性较好[8]，推测两种检测方法的一致性与入组患者类型有关，有待进一步研究。本研究结果显示，恒温扩增法较培养法更容易检出混合感染样本，而培养法更易检出单一感染病原菌，与李松等[8]研究结果一致，其原因可能是传统培养技术存在优势菌抑制其他菌种生长，或挑选优势菌鉴定而忽略其他杂菌或恒温扩增法存在假阳性，建议在做临床评估时结合多种检测结果进行综合诊断。

掌握儿童下呼吸道感染的病原菌谱，对于指导临床早期用药治疗具有重要意义。本研究结果显示，下呼吸道感染的主要病原菌为肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、肺炎支原体、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌等，与李自强等研究结果一致[9]；其中，流感嗜血杆菌与肺炎支原体在恒温扩增法中的检出率位居前三位，是临床需要格外注意的高发、常见儿童下呼吸道感染病原体，但在传统病原培养法中，该两种病原体的培养困难，尤其是流感嗜血杆菌，作为苛氧菌的一种，对样本要求、培养条件、送检时间、人员技术等各方面都要求严格，极易出现假阴性的结果。而目前对儿童下呼吸道感染的取样上暂无统一性的标准和规范，加上儿童患者依从性较差，取样困难，导致临床上对儿童下呼吸道感染的病原检测往往难以从样本来源上进行规范控制。

另外，值得注意的是，相关研究发现多种病原体混合感染占有较大比例，且混合感染组合形式呈现多样性[10-11]，与本研究结果一致。目前关于混合感染是否会对肺炎的病情严重程度产生影响观点不一，有研究认为混合感染较单一感染可加重临床症状、引起更加强烈的炎症反应、增加儿科重症监护室入住率[10]，也有研究认为二者关联不大[12]。因此，未来笔者也会增加更多研究来判断混合感染是否对呼吸道感染病情程度具有影响性。

综上所述，相较于传统培养法，恒温扩增芯片法检测技术灵敏，阳性率更高，可以辅助临床快速、准确判断下呼吸道感染的致病原，以便有针对性地进行用药和治疗。但由于致病菌谱的复杂多阳性，在临床使用时及应根据下呼吸道病原体的特性及流行病学特点，采用多种检测方法联合使用的策略，以降低假阴性和假阳性结果，提高检测的特异性和敏感性，实现病原体的多元化快速简便检测。