SERPINE1介导miR-660信号影响肝癌细胞增殖的实验研究

金丽娟,范海涛,马晓燕,陈 淼,张爱芸

肝癌是世界上最常见的癌症之一，全球因肝癌死亡的人数已超过80万。据世界卫生组织(WHO)估计，在未来10年内预计将有100多万患者将死于肝癌[1]。肝癌的危险因素包括乙型或丙型肝炎、肝硬化、酗酒、环境因素以及酒精性脂肪肝、糖尿病和肥胖等代谢性疾病，还包括吸烟以及遗传因素[2]。虽然外科手术切除和肝移植等治疗方法的进步显著提高了肝癌患者的预期寿命，然而这些治疗手段主要适合肝癌晚期患者[3]。此外，经动脉化栓塞治疗(TACE)已经成为重要的肝癌姑息治疗方法，然而根据目前的临床证据，TACE对具有某些特定遗传特征的肝癌患者并没有明显的疗效[4]。因此，有必要深入探讨肝癌的发病机制并寻找有效的治疗靶点。本研究拟通过数据库分析以及体外研究初步探讨SERPINE1在肝癌细胞增殖中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料:2019年6月基于GEPIA数据库资料，分析SERPINE1在肝癌及癌旁组织中的表达情况。筛选条件：①Expression DIY；②Gene：SERPINE1；③|Log2FC|Cutoff：1；④p-value Cutoff：0.05；⑤Datasets Selection：LIHC；⑥Log Scale：Yes；⑦Matched Normal data：Match TCGA normal and GTEx data。

1.2 试剂与方法

1.2.1 主要试剂: Trizol RNA提取试剂、miScript Ⅱ RT Kit反转录试剂盒以及双荧光素酶检测试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；SYBR Mastermix购自北京天根生化科技有限公司；SERPINE1过表达载体以及Real-time PCR检测引物委托上海吉马有限公司合成；Lipofectamine 2000细胞转染试剂购自Invitrogen公司；CCK-8检测试剂购自碧云天生物技术有限公司；双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司。

1.2.2 细胞培养:人肝癌细胞系Huh-7、HB611、SMMC-7721以及HepG2细胞均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。HCCLM3细胞购自中乔新舟(上海)有限公司。各细胞系复苏后加入含有10%胎牛血清以及1%双抗的高糖DMEM培养液，置于37 ℃、5%二氧化碳的培养箱中培养。隔天换液，待细胞长至铺满培养瓶时进行传代。

1.2.3 荧光定量 PCR:采用Trizol试剂提取细胞的总RNA，将其稀释成50 μg/mL，使用特异性反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。用SYBR Green qPCR Mix进行实时荧光定量PCR反应，反应条件为：95 ℃ 预变性10 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，35个循环。检测溶解曲线，分析各样本Ct值，分别以GAPDH或者U6为内参，2-(△△Ct)法计算mRNA的相对表达量。实验中所用引物序列见表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.2.4 细胞转染:待细胞长至70%～80%融合时进行细胞转染。按照1.5×104个细胞/孔的密度将其接种于6孔板中，采用Lipofectamine 2000试剂进行转染，分别将空载体Vector或者SERPINE1过表达载体转染至SMMC-7721细胞中，转染24 h后用Real-time PCR检测SERPINE1的表达验证过表达效率。

1.2.5 CCK-8检测细胞增殖:将各组细胞按照2×103个细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板，分别培养0 、24、48、72 h和96 h后，各孔加入100 μl的混合培养液，其中含有90 μl的DMEM完全培养液以及10 μl的CCK-8试剂培养细胞3 h，于标仪上测定各组细胞在450 nm处的吸光度值。

1.2.6 双荧光素酶活性检测:采用SERPINE1的野生型载体(SERPINE1-wt)或者其突变型载体(SERPINE1-mut)，分别和NC mimic或者miR-660 mimic共转染293T细胞检测SERPINE1与miR-660的结合情况，转染48 h后采用素酶活性检测试剂盒检测细胞的荧光强度。

1.3 统计学方法:采用GraphPad 8.0统计软件，2组间比较采用t检验、ANOVA检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SERPINE1在肝癌组织中的表达:利用GEPIA网站分析来自TCGA和GTEx项目的369例肝癌样本以及160例癌旁组织中SERPINE1的表达情况，结果显示在肝癌组织中SERPINE1的表达水平显著低于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1(封二)。

2.2 SERPINE1在肝癌细胞中的表达:荧光定量PCR检测了5株肝癌细胞中SERPINE1的表达，结果显示SERPINE1的mRNA在肝癌细胞Huh-7、HCCLM3、HB611、SMMC-7721以及HepG2中的相对表达量分别为1.00±0.00、3.36±0.25、1.58±0.09、0.25±0.08、0.86±0.21，因此选择SERPINE1表达最低的SMMC-7721和表达最高的HCCLM3细胞进行后续研究。在SMMC-7721细胞中转染SERPINE1过表达载体，48 h后采用荧光定量PCR检测SERPINE1的表达，结果显示，SERPINE1过表达载体转染的细胞中SERPINE1的表达显著高于空载体转染的细胞(6.01±0.72与1.21±0.32)，差异具有统计学意义(P<0.05)。在HCCLM3细胞中转染SERPINE1干扰片段，结果显示与阴性对照siRNA转染的细胞相比，3个SERPINE1 siRNA片段转染的细胞中SERPINE1的表达水平均显著降低(0.89±0.06与0.31±0.05、0.63±0.03、0.55±0.05)。其中，SERPINE1 siRNA1的干扰效果最好(P<0.05)，因此，选择SERPINE1 siRNA1进行后续实验。

2.3 SERPINE1对肝癌细胞增殖的影响:分别于转染SERPINE1过表达载体或者干扰片段后的不同时间点采用CCK-8检测细胞的增殖情况，结果显示与对照细胞相比，转染SERPINE1过表达载体后细胞增殖水平降低,见表2；转染SERPINE1干扰片段之后细胞的增殖水平升高,见表3。结果提示SERPINE1能够负向调控肝癌细胞的增殖。

表2 过表达SERPINE1对细胞增殖的影响

表3 下调SERPINE1对细胞增殖的影响

2.4 miR-660对SERPINE1的调控作用:预测显示SERPINE1上存在有miR-660的结合位点(图2，封二)，因此采用双荧光素酶检测了二者的结合情况。结果显示，野生型SERPINE1载体与miR-660 mimic共转染的细胞中双荧光素酶的活性显著低于其他各组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2(封二)。此外，在HCCLM3细胞中转染miR-660 mimic，48 h后检测SERPINE1的表达，结果显示与NC mimic转染组相比，miR-660 mimic转染的细胞中SERPINE1水平显著降低(0.95±0.09与0.57±0.05，P<0.05)，提示SERPINE1受到miR-660的靶向调控。

2.5 SERPINE1介导了miR-660对肝癌细胞增殖的调控:在HCCLM3细胞中分别单独转染miR-660或者共转染miR-660和SERPINE1，转染48 h后CCK-8检测各组细胞的增殖情况。结果显示，与对照组相比NC mimic组的增殖能力没有显著变化(0.584±0.052与0.623±0.074，P>0.05)；与NC mimic转染组相比，miR-660 mimic显著促进了细胞的增殖(0.623±0.074与1.342±0.141，P<0.05)；与miR-660 mimic组相比，miR-660-mimic+Vector组无显著变化(1.342±0.141与1.285±0.082，P>0.05)；与miR-660-mimic+Vector组相比，miR-660-mimic+SERPINE1细胞的增殖能力显著降低(1.285±0.082与0.833±0.136，P<0.05)。

3 讨论

SERPINE1是一种纤维蛋白溶解抑制剂，已有多项研究证明其在癌症中的异常表达，如SERPINE1在结直肠癌中的高表达，并与肿瘤的迁移和侵袭有关[5]。此外，有报道SERPINE1与黑色素瘤[6]、食管癌[7]和膀胱癌[8]的进展有关，然而其在肝癌中的作用还未见报道。本研究结果显示，SERPINE1在肝癌组织中显著降低，并且高表达SERPINE1能够抑制肝癌细胞的增殖，下调SERPINE1可以促进肝癌细胞的增殖，因此，推测SERPINE1能在肝癌细胞中发挥抗肿瘤的作用，上调SERPINE1有望成为治疗肝癌的新方法。

miR-660-5p也被简称为miR-660，目前被证明为一个促肿瘤的miRNA，抑制miR-660的表达能够抑制乳腺癌的增殖及转移[9]。转染了miR-660 inhibitor的肾癌细胞增殖能力显著降低，则细胞的凋亡率显著升高[10]。前期研究结果显示，lncRNA ASMTL-AS1可以通过吸附miR-660调控肝癌细胞的增殖[11]，然而miR-660通过何种机制影响肝癌细胞增殖仍未十分明确。miRNA是一类长度在20～25个碱基的内源性非编码RNA，miRNA能够结合于互补mRNA的3′非翻译区，诱导靶mRNA的降解或者抑制其翻译。本研究结果证明miR-660能够靶向调控SERPINE1，上调miR-660能够显著抑制SERPINE1的表达。因此，我们推测miR-660通过调控SERPINE1影响了肝癌细胞的增殖。

综上所述，本研究结果表明SERPINE1能够抑制肝癌细胞的增殖，并且将SERPINE1作为miR-660的靶基因，能够介导miR-660对肝癌细胞增殖的调控，上调SERPINE1有望成为抗肝癌的潜在的治疗手段。