加工诱导形成的食源性荧光碳点研究进展

乔凤至，侯 率，谭明乾*

（大连工业大学食品交叉科学研究院，食品学院，国家海洋食品工程技术研究中心，海洋食品精深加工协同创新中心，辽宁 大连 116034）

食源性荧光碳点（food-borne fluorescent carbon dots，FFCDs）是一类具有荧光特性的以碳为主要成分的点状纳米粒子，其主要是食品组分在物理加工如加热和微波等作用下发生复杂物理化学变化而形成的新型三维纳米结构，其尺寸一般从小于1 nm到几十纳米不等。在经加工处理过的面包及焦糖、烤制的肉类、面包皮、烤汉堡、烤披萨、黄花鱼罐头等固体食品及茶、商业化饮料、啤酒、熟醋、蜂蜜、牛肉汤等液体食品中都发现存在FFCDs。大部分天然食品原料中含有糖类、蛋白质等成分，在加工诱导过程中不断自我钝化最终形成纳米级碳点。FFCDs不仅来源广泛，简单易得，而且制备方法多样，结构稳定。从物性方面来说，FFCDs具有纳米级的尺寸及高通透性，表面含有大量的羟基、羧基等亲水性官能团，还具有激发波长依赖性及较好的pH值稳定性等特点。在功能特性方面，FFCDs因其优良的性质，在生物传感成像、食品组分分析、药物递送载体、防伪验证、荧光靶向示踪、印刷喷绘等多个领域有着广阔的应用前景，有望成为无机纳米粒子的良好替代品。通常，FFCDs普遍存在于日常加工的食物中，由于其尺寸效应和高通透性，能随饮食进入人体胃肠内，它在人体内的消化及吸收过程如何，以及是否会引发安全性等一系列问题，都需要更深入的研究验证。

虽然FFCDs在加工食品中是普遍存在的，但其物化性质、生物效应以及长期摄入人体的安全性等仍存在许多问题，揭示FFCDs的生物效应机制和安全性等仍需要进行大量的研究工作。王秋月、刘文、Huang、Liu Mengli等曾发表过侧重于食品源碳点制备和应用方面的综述，这些综述旨在总结以食品成分为原料制备荧光碳点用于荧光传感等方面的应用，而有关食品加工诱导产生的FFCDs的系统性论述尚属空白，所以本文重点围绕关于FFCDs的发现、提取及形成机制、理化性质、生物效应与安全性方面进行综述。

1 食品加工中FFCDs的发现与提取

以来源丰富、价格低廉、环境友好且安全可靠的食物或食品为原料加工诱导形成FFCDs，不仅操作简单，而且符合当前人们所倡导的绿色化学理念。当食品原料经过烤制、高压煮制、水热、微波等加工处理条件后，其内部含有的蛋白质、脂类和碳水化合物等物质会发生复杂的物化反应（如酯化、羰基化和焦糖化），从而导致水分损失、变性和氧化等，并进一步缩聚成纳米级的FFCDs，而不同加工方式诱导食品产生的FFCDs理化性质及应用也略有差异。未经加工处理的食品原料本身不含有FFCDs，因此，加工诱导是FFCDs形成的必要条件。关于食品热加工诱导产生FFCDs最早可追溯到2012年，Sk等发现在面包、棕榈糖和焦糖等热加工食品中存在粒径在4～30 nm之间的不定形FFCDs，它们具有紫外光激发下发射荧光的特性。一般来说，FFCDs的分离纯化手段依据原料种类不同而略有差异。FFCDs可以直接利用乙醇等溶剂提取，然后通过旋转蒸发富集浓缩，除去醇不溶性的蛋白质、碳水化合物等物质，然后采用氯仿或乙酸乙酯等有机溶剂继续多次萃取，以去除脂类杂质，最后利用D101大孔树脂柱、Sephadex G-25凝胶过滤色谱柱及C反相色谱柱等进一步除掉醇溶性蛋白、无机盐和生物小分子等，获得相对纯净的FFCDs。

2 FFCDs的形成机制

天然的食物原料作为人类赖以生存和发展的物质基础，是一种包含了碳水化合物、脂类、蛋白质、水和矿物质等多组分的复杂体系。不同来源食物的基质组分含量、种类和加工方式各不相同，导致FFCDs的形成机制也存在差异，几种具有代表性的研究实例如下。

De等以香蕉汁中的碳水化合物和VC充当碳源，在水热条件下，不同碳水化合物发生水解、脱水和分解，产生可溶性化合物，然后发生聚合和缩合，转变成不同的可溶性聚合物，进而通过环化加成反应进行芳构化和碳化。最后，这些聚合物团簇在过饱和点的临界浓度下成核，最后形成FFCDs。李欣彤等研究发现牛奶和鸡蛋清中的蛋白质在水热条件下与葡萄糖发生美拉德反应，进一步形成FFCDs。蛋白质的氨基与葡萄糖羰基之间发生羰氨反应，然后引发后续的缩合、环化和聚合等，从而产生具有共轭结构的FFCDs。Zhang Zehui等提出了利用蛋清中的蛋白质基于水热合成FFCDs的可能机制，在水热处理的初期，蛋清中的蛋白质先被水解成小的低分子质量的肽和氨基酸，然后氨基酸部分聚合并碳化形成被许多低聚物包被的碳核。随着反应的进行，碳核逐渐变大，而外部低聚物则逐渐减少或消失，最终产生了带有大量羟基和羧基官能化的氮掺杂的FFCDs。Edison等报道了利用欧洲甜樱桃果提取物水热形成FFCDs，主要是利用樱桃果提取物中的葡萄糖和苹果酸，经过脱水、聚合、碳化/芳构化和钝化等一系列复杂的过程得到FFCDs。2018年，Bi Jingran等对源自烤海鳗鱼中的FFCDs形成机制进行了探讨，提出其主要包括聚合、热解、核化、生长、聚集及成核等多个阶段。海鳗鱼中富含脂质、蛋白质、碳水化合物等，在受热早期（160 ℃条件下），鱼肉中的组分发生涉及热诱导聚合、脂质氧化及热解等多种反应，形成大尺寸不规则的异质聚合物。随着烤制温度升高至200 ℃，聚合物不断通过热分解，同时通过美拉德反应等产生碳核并进一步形成自组装纳米结构。当温度升高到230 ℃时，热分解与碳化反应继续增强，碳核不断增多。直至烤制温度至260 ℃，高温导致碳碳键断裂，形成较多的FFCDs。最后当烤制温度达到300 ℃，形成了均匀单分散的FFCDs。2019年，Geng Jiaxin等在高压煮制的牛肉汤中提取出FFCDs，研究30、50 min与70 min煮制时间对纳米颗粒的粒径的影响，结果发现时间越长，最终得到的FFCDs粒径越小，且70 min高压煮制牛肉汤中的FFCDs具有最长的荧光寿命与荧光量子产率，说明可能是持续的高温反应加剧了碳核的收缩。

综上，由于食物原料的差异性、营养组分的多样性、加工过程的复杂性等，FFCDs的形成机制既存在共性的一面，也存在一定的差异。

3 FFCDs的性质

3.1 形貌、结构与尺寸特征

纳米级的FFCDs总体呈现分散性较好的类球形结构，粒径一般在10 nm以下，但也有部分可以达到几十纳米。X射线衍射图谱显示绝大部分FFCDs主要在2＝20°附近存在一个较宽的单峰，例如以脱水香菇和猪皮为原料经加工处理获得的FFCDs的X射线衍射峰2分别为20.5°和23.8°，从烤鸭肉和烤披萨中提取的分别为23.36°和20.7°，表明FFCDs主要为无定形的非晶结构。通过对高分辨率透射电镜进一步分析显示，FFCDs可能存在无定形与晶格两种形貌结构。拉曼光谱则显示FFCDs由sp杂化和sp杂化的碳原子组成。FFCDs的结构与粒径可能取决于它形成过程中的条件，尤其是原材料、加工方式、处理温度、时间等。Li Yao等研究了不同烤制温度对烤牛肉饼中提取的FFCDs性质的影响，发现在相对较低的温度（220 ℃）下，形成的FFCDs粒径相对较大，随着烤制温度的提高（260 ℃和300 ℃），碳化程度不断加深，形成的FFCDs粒径逐渐减小，并可以观察到清晰的晶格条纹，推测FFCDs具有明显的晶格结构。

3.2 元素组成及表面官能团

FFCDs通常由碳、氧、氢等元素组成，其中尤以碳含量最高，由于FFCDs来源于加工食品，因此部分也会掺杂氮和硫等元素。Zhou Jiaojiao等利用X射线光电子能谱分析显示，西瓜皮经水热诱导形成的FFCDs中，碳元素占比64.65%，之后依次为氧26.55%、氢7.67%及氮1.13%。Cong Shuang等从烤鸭肉中提取纯化的FFCDs中碳质量分数高达70.48%，并含有少量硫元素（1.11%）。FFCDs表面含有如羧基、氨基和羟基等种类丰富的官能团，这些基团的存在既赋予了其优良的亲水性和荧光特性，也增加了FFCDs与其他体内生物物质相互作用的可能性。Wang Haitao等从啤酒中纯化出FFCDs的傅里叶变换红外光谱图主要在4个位置出现吸收峰，分别对应—NH/üOH、—CH—、—COOH及—C＝C—，通过进一步分析高分辨率X射线光电子能谱，显示FFCDs存在—C＝C—、—CüC—、—CüN—、—Cü

O—、—C＝O、—NH、—OüH、*O＝CüO、O＝CüO*等特征峰，证实了啤酒FFCDs表面有大量活跃官能团的存在。Wang Nanying等还利用核磁共振氢谱分析了从烤牛肉中提取的FFCDs可通过羟基和氨基等与Fe发生螯合反应，提示了FFCDs作为纳米载体在开发微量元素补充剂方面的潜力，同时用于对Fe离子的检测。Miao Hong等发现以番茄汁为前体材料获得的FFCDs，表面羧基、羟基含量较高，通过π-π堆积作用吸附癌胚抗原适配体，从而用于肿瘤标志物癌胚抗原的检测。

3.3 荧光特性

荧光特性是FFCD最突出的理化性质之一，目前已经报道的FFCDs主要以蓝色荧光和绿色荧光为主，也有少量表现出黄色荧光（表1）。一般来说，FFCDs的荧光发射光谱会随着激发波长的增加而红移，即具有典型的激发波长依赖性。某些FFCDs还具有上转换荧光性质，属于反斯托克斯荧光发光（发射波长比激发波长短），例如，Alam等以卷心菜为原料通过水热法产生的FFCDs，当激发波长在600～800 nm时，在485 nm附近的发射波长处产生强烈的上转换荧光。关于FFCDs荧光性质产生机制的主要观点包括表面态、量子约束效应及分子荧光等。

表1 FFCDs的性质与应用Table 1 Properties and applications of FFCDs

续表1

荧光量子产率（quantum yield，QY）作为衡量FFCDs荧光特性的重要参数，它的值越大说明荧光性发射能力越强。荧光量子产率与原材料和反应条件密切相关，一般采用硫酸奎宁和罗丹明6G等为参比物进行参比测定，例如从茶、速溶咖啡、饮料、啤酒、陈醋、蜂蜜、牛肉汤等液体食品中提取的FFCDs，QY都低于10%，而烤牛肉中FFCDs的QY则可以达到40%。Bi Jingran等研究了不同烤制温度（160～300 ℃）对烤海鳗鱼FFCDs QY的影响。随着温度升高，QY从最低的12.86%增至80.16%。此外，荧光寿命是荧光物质在激发态的统计平均停留时间，通常FFCDs的荧光寿命为纳秒级别。

FFCDs可以经过不同加工手段诱导产生，其理化性质和应用并不完全相同（图1）。FFCDs的荧光稳定性对其后续细胞及体内器官分布示踪至关重要，目前的报道主要集中在FFCDs存储时间、紫外光、离子强度、pH值、金属离子对稳定性影响等方面（表1）。研究表明，FFCDs具有良好的贮存稳定性。Bi Jingran等从烤海鳗鱼中纯化出FFCDs，在常温放置一个月后，FFCDs的荧光强度无明显下降。利用微波处理菠萝蜜种子后得到氮掺杂FFCDs，其荧光强度在室温长期贮存180 d内同样无显著变化。另外，FFCDs具有良好的抗光漂白特性，无论是从烤披萨还是烤鸭肉中提取的FFCDs，在最大激发光波长连续照射30 min条件下，未见荧光强度有明显改变。因原料和加工处理条件的差异，FFCDs对溶液离子强度与pH值的耐受性并不完全相同。来源于烤海鳗鱼的FFCDs在高达2 mol/L的NaCl浓度下，荧光强度依然很稳定。而在NaCl浓度仅为1 mol/L时，从200 ℃烤制鸭肉中纯化的FFCDs的荧光强度出现了明显波动，从100%降至73.16%，但300 ℃纯化的FFCDs却依然稳定。烤披萨中FFCDs的荧光呈现明显的pH值依赖性，在近中性较稳定，在酸性和碱性条件下则部分淬灭。来源于扁红豆的FFCDs在不同pH值（3～13）溶液中的荧光强度几乎相同。而南瓜来源的磷氮共掺杂的黄色荧光FFCDs，其荧光强度随pH值从1.5变化到7.4逐渐增强，且在pH值范围为4.7～7.4内呈现出良好的线性关系。对于金属离子这一因素来说，大部分FFCDs荧光稳定性几乎不会受到如Mn、Fe、Zn、Mg、Ca等多数金属离子的影响，但有很多容易被Fe离子淬灭，另有少数则对Hg、Au或Ag敏感，因此FFCDs可用于检测食品包装或食品中某些金属离子的含量是否超标。

图1 利用几种典型的加工方式从食品中（烤海鳗鱼[25]、菠萝蜜种子[48]、速溶咖啡[40]、龟壳[49]）诱导产生FFCDs的部分理化性质及应用Fig.1 Physicochemical properties and applications of FFCDs induced by different processing methods from foods (roasted pike eel[25], jackfruit seeds[48], instant coffee[40] and turtle shell[49])

4 FFCDs的生物效应与安全性

FFCDs是食品营养组分经过外界物理场加工衍生而来，人们关心它经口服进入体内胃肠后，是否会对机体产生正面或负面的影响。虽然理论上相比传统的无机或金属等纳米材料具有更好的生物相容性，但是其结构相较于加工前发生了很显著变化，表现出纳米级物质独有的一些特点，如超小尺寸、高比表面积、高催化特性、较强的渗透和通过性质等，因此非常有必要对FFCDs的生物效应与安全性进行深入系统的讨论与研究。目前这部分的研究尚处于起步阶段，以后仍有大量的工作有待于开展。

4.1 体外模拟消化

现阶段，体外消化模型因其简单、廉价、可重复性高、可实现多样本同时检测等优点被广泛应用于药物剂型分解、营养成分生物利用度、物质消化等研究中，同时，还可监测机体胃肠道对食物或药物的消化行为、消化部位等。一般来说，FFCDs随食物经口摄入后，首先需要克服胃肠道屏障才能到达循环系统，而胃肠道复杂的消化环境可能会造成FFCDs形貌、结构、溶解性等理化性质的改变。通常采用体外模型来模拟体内消化环境，常用的包括静态模型和动态模型，多数研究集中在静态模型。Li Shen等分别用人工唾液（pH 6.5，5 min）、胃液（pH 2，120 min）和十二指肠胆汁液（pH 8，120 min）模拟源自可口可乐FFCDs在口腔、胃和肠道的消化过程，在连续处于人工唾液、胃液和十二指肠胆汁液的环境中分别约有69.97%、23.28%和6.23%的荧光发生淬灭。Wang Haitao等利用类似的方法对雪花啤酒中的FFCDs研究结果显示，FFCDs的荧光强度在胃液中猝灭率最高，为65.2%，唾液和肠液中猝灭率相对较低，但消化后仍可见荧光信号，这有助于对FFCDs的后续追踪。Song Yukun等同样发现烤三文鱼中FFCDs的荧光强度受唾液影响较小而受胃肠液影响较大，并通过进一步的探究发现FFCDs与胃蛋白酶和胰蛋白酶等胃肠道消化酶存在相互作用，从而对酶的活性产生抑制作用（图2A）。

4.2 吸收、分布、代谢与排泄的特点和规律

研究FFCDs在生物体内的吸收、分布、代谢与排泄（adsorption, distribution, metabolism and excretion，ADME）过程的特点和规律，对于FFCDs的生物安全性评价和体内应用至关重要，目前研究者们主要通过监测荧光信号来研究其ADME过程。Song Yukun等利用大鼠翻转肠囊模型，将不同质量浓度来自烤三文鱼的FFCDs置于肠囊内侧，然后从肠囊外侧取样检测其荧光强度，结果发现FFCDs的荧光强度随FFCDs质量浓度增加呈现先增加后减小的趋势，且高浓度转运速率强于低浓度，证实FFCDs可以被小肠吸收从而进入血液循环系统。Zhao Xue等利用尤斯室模型体外模拟研究烤猪肉FFCDs在小鼠小肠中的渗透吸收情况，结果表明其透过量和累积透过量随时间延长而增加，且具有浓度依赖性效应，浓度越大，上升越明显，而表观渗透系数随时间延长则先急剧下调再缓慢上升，由此推测FFCDs以被动转运的方式透过肠黏膜被吸收。大量体外细胞摄取实验结果显示，FFCDs能进入细胞并被摄取利用，一部分FFCDs分布于细胞质，也有部分在细胞核与细胞质皆有分布，胞内分布的差异不仅与FFCDs的来源有关，也可能与FFCDs的使用浓度有关（图2B）。

图2 食源性荧光碳点的生物效应Fig.2 Biological effects of FFCDs

Song Yukun等通过BALB/c小鼠灌胃结合活体荧光成像实验对源自烤三文鱼的FFCDs在小鼠体内各器官的分布情况进行了分析（图2C），发现小鼠的小肠、胃、肾、肝和脑的荧光强度陆续达到最大值，但肺部的荧光强度却几乎没有变化，表明FFCDs能够代谢到除肺部以外的多个器官中。值得注意的是，在小鼠的脑内也能观测到FFCDs的荧光信号增强，因此FFCDs能够穿过血脑屏障，在小鼠的脑部分散。值得注意的是，小鼠在灌胃24 h后，各个主要脏器的荧光信号强度皆回到正常水平，推断FFCDs有可能被代谢出小鼠体外。基于同样的方法，Li Shen和Wang Haitao等分别发现从可乐和啤酒中提取的FFCDs皆能够代谢分布于小鼠的肠、肝和脑，而在肺和肾脏等器官则没有检测到明显的荧光强度变化，但Zhao Xue等发现烤猪肉FFCDs在小鼠的心脏、肾脏、大脑、肠、肺、胃、肝和睾丸等多个器官皆有分布。有研究发现，分别将来自烤鸭和烤披萨的FFCDs掺杂在大肠杆菌OP50中喂食野生型秀丽隐杆线虫后，在线虫的肠道中皆观察到明亮的蓝色荧光，FFCDs被线虫吸收后大部分分布在肠道内。总之，FFCDs自身独具的荧光特性为体内体外的荧光成像提供了可能，但是深入追踪其体内分布及代谢途径，阐明其在人体内的消化过程及代谢的途径仍是一项挑战。

4.3 与生物分子的相互作用

FFCDs通过羟基、羧基等基团或不饱和键等表面结构，与大分子蛋白、小分子氨基酸或金属离子之间发生相互作用力而结合成健，为进一步递送功能性营养因子提供了可能。

当纳米粒子进入生物系统后，会接触到蛋白质一类的具有生物活性的大分子物质，纳米粒子的表面不断迅速吸附蛋白质并被迅速覆盖，形成一层或多层冠状结构，称之为蛋白冠。据报道，FFCDs能与血浆中的人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）主要通过静电作用自发结合，并且会导致HSA内源性荧光发生静态猝灭，圆二色谱结果进一步表明FFCDs还会导致HSA构象的改变。HAS的结构存在两个结合位点，分别是位点I（亚结构域IIA）和位点II（亚结构域IIIA）。利用华法林和布洛芬竞争（位点特异性标记试剂）的实验表明，烤鸡胸肉中的FFCDs主要与位点I结合（图2D），而来源于烤三文鱼中的FFCDs则与位点I和位点II皆有结合。FFCDs与蛋白质相互作用形成蛋白冠后还会影响FFCDs的生物毒性。Song Yukun等对烤三文鱼FFCDs与HSA的深入研究发现，蛋白冠的形成可以降低FFCDs的细胞毒性，促使细胞能量代谢由糖酵解向有氧呼吸转变，并减缓FFCDs引起糖代谢和脂代谢的紊乱。另有研究表明FFCDs还能与神经递质（多巴胺）以及消化酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）等蛋白相互作用。FFCDs作为递送载体能与锌、铁离子等发生螯合，拓宽了微量元素补充剂的开发途径。Geng Jiaxin等研究表明FFCD与Zn主要通过与氨基氮原子（NüH）和羧基（—COOH）或羟基（OüH）氧原子结合。Wang Nanying等比较了从不同烤制温度、时间的牛肉中纯化出的FFCDs与铁的螯合率，可能由于随着焙烧时间延长，FFCDs表面的羟基数量减少，导致与铁的螯合率降低。

4.4 抗氧化作用

自由基是机体正常细胞代谢产生的一种代谢物和信号分子，主要包括ROS自由基和活性氮自由基，这些自由基含有未成对电子，使它们易于与其他分子反应，这种现象称为氧化。而当自由基过量存在并超过体内抗氧化防御机制所能清除的水平时，就会引起机体氧化应激，进而导致机体衰老及癌症，以及心血管类疾病、自身免疫系统疾病和神经衰退性疾病等疾病的发生。研究表明，以姜汁为原料水热合成的FFCDs和从面包皮中提取的FFCDs会导致胞内ROS水平升高。但另有研究显示，FFCDs能够通过清除自由基而发挥抗氧化作用。Sachdev等利用吸光度法证实以香菜叶为原料水热合成的FFCDs能够明显清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基。Huang Gang等利用类似的方法发现以富含酚类成分的甘蔗糖蜜为原料水热合成的FFCDs同样能够有效清除DPPH自由基，并推测FFCDs的这种抗氧化作用与其表面的酚羟基有关。Li Jiaqi等利用电子自旋共振（electron spin resonance，ESR）技术证实从烤鲭鱼中纯化的FFCDs对由芬顿反应产生的羟自由基和由亚甲蓝可见光光敏反应产生的甲基自由基皆具有明显清除效果。Wang Haitao等同样利用ESR技术证实烤羊肉FFCDs能够有效清除羟自由基和DPPH自由基，且发现这种清除能力与烤制温度有一定的相关性，烤制温度越高自由基清除能力也相对越好，并进一步利用HO诱导细胞氧化应激结合测定细胞活力的系列实验证实，FFCDs对细胞氧化损伤起到一定的保护作用。Das等通过高锰酸钾还原实验、DPPH自由基清除以及细胞水平的羟自由基清除实验和超氧化物活性抑制实验等证实了以海枣糖蜜为原料利用微波法合成的FFCDs具有较好的抗氧化作用，并推测其对自由基的清除作用依赖于表面富含的能够充当质子供体的羟基、醛基和酮基等活性基团（图2E）。

4.5 细胞毒性

细胞作为人体结构和生理功能的基本单位，其活力能在一定程度上反映机体的变化，是研究FFCDs的常用评价体系。大量研究表明，FFCDs可以被细胞摄取，目前针对FFCDs细胞毒性作用的研究主要集中在FFCDs对细胞活力、细胞周期、细胞凋亡及细胞能量代谢等方面。

细胞活力测定是细胞毒理学检测中最常用的一个指标，常用的细胞活力检测方法包括MTT法、WST-1法、细胞毒性实验（cell counting kit-8，CCK-8）以及实时细胞分析（real-time cell analysis，RTCA）法等，前3种方法属于细胞终点代谢物的检测法，而RTCA法则是基于细胞实时无标记动态检测原理进行的。利用MTT法，以小鼠胚胎成骨细胞系MC3T3-E1为模型，Bi Jingran等评价了从烤海鳗鱼中提取的FFCDs对细胞活力的影响，结果发现质量浓度高达20 mg/mL的FFCDs处理24 h时，小鼠成骨细胞活力没有明显的改变，而Li Yao等则考察了不同烤制温度的烤汉堡FFCDs对小鼠成骨细胞活力的影响，采用220、260 ℃和300 ℃烤制形成的FFCDs（质量浓度3.2 mg/mL）处理小鼠成骨细胞24 h后发现，细胞活力分别下降约5%、15%和21%，推测高温烤制会通过增加碳化程度增强FFCDs的细胞毒性。同样利用MTT法研究发现，以榴莲、大蒜皮、蛋清、猪皮、菠萝蜜种子、香菜叶、花生壳、牛奶、淀粉、猕猴桃、卵清蛋白等作为前体物质，经加工合成的FFCDs分别处理不同细胞后，细胞活力变化不明显或随FFCDs浓度增加略有下调。但Li Dongmei等从黄花鱼罐头中提取出的FFCDs质量浓度大于2 mg/mL时，肝癌细胞活力大幅急剧下降约90%（图3A）。此外，利用CCK-8法测定结果表明，来自百事可乐或速溶咖啡的FFCDs（20 mg/mL）处理中国仓鼠卵巢细胞系CHO 24 h，细胞活力无明显改变。Huang Gang等用人乳腺癌细胞系MCF7并通过WST-1法研究发现，以甘蔗糖蜜水热合成的FFCDs在经0.2～4.0 mg/mL的质量浓度范围内处理后，对细胞活力同样影响不大（图3A）。Wang Haitao等通过RTCA法考察了啤酒FFCDs对MC3T3-E1细胞活力的影响，发现最初的3 h内FFCDs对细胞指数影响不大，而随着时间继续延长，则以剂量依赖性方式诱导细胞指数逐渐下降，可能产生细胞毒性。

图3 FFCDs的细胞安全性评价Fig.3 Evaluation of cytotoxicity of FFCDs

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，它能够保证生命在亲代和子代之间的连续性，从而发挥关键的调控作用，细胞周期紊乱与肿瘤等疾病的发生有十分重要的关联性。真核生物细胞周期主要包括间期和分裂期（M期），间期再细分为DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）和DNA合成后期（G2期）。细胞受到外界刺激物作用，发生损伤，会导致细胞凋亡（又称程序性细胞死亡）。目前，主要通过碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色或Annexin V-FITC/PI双染后利用流式细胞仪对细胞周期和细胞凋亡分别进行测定。Cong Shuang等研究发现，5 mg/mL烤披萨FFCDs处理正常大鼠肾上皮细胞系NRK 12 h后，G0/G1期的占比由对照组的49.47%提高到57.63%，表明烤披萨FFCDs会导致细胞阻滞在G0/G1期（图3B）。进一步通过细胞凋亡实验检测发现，早期凋亡（如果Annexin V单阳性则说明细胞发生早期凋亡，而Annexin V和PI双阳性则提示细胞发生晚期凋亡）细胞数会由对照组的4.72%提高到18.2%，表明烤披萨FFCDs会明显促进细胞的早期凋亡（图3C）。Wang Haitao等以人肝癌细胞系HepG2为模型，发现来自烤羊肉的FFCDs会导致S期部分阻滞和细胞的早期凋亡。Wang Haitao等以MC3T3-E1为模型研究了啤酒FFCDs对细胞周期和细胞凋亡的影响，发现采用质量浓度4 mg/mL FFCDs处理细胞4 h后，G2/M期的占比由对照组的9.6%提高到17.5%，同时Annexin V阳性细胞的占比也明显增加，表明啤酒FFCDs会促进G2/M期阻滞和细胞凋亡。

此外，也有报道指出FFCDs会影响细胞能量代谢。Li Dongmei等利用Seahorse XFp分析仪通过监测氧气消耗速率（oxygen consumption rate，OCR）和细胞外酸化速率（extracellular acidification rate，ECAR），考察了黄花鱼罐头FFCDs对线粒体呼吸和糖酵解的影响，结果发现FFCDs处理后，OCR和ECAR水平皆呈现剂量依赖性趋势，低浓度FFCDs组变化不明显，而高浓度FFCDs组皆明显下降，表明高剂量FFCDs会抑制线粒体呼吸和糖酵解，进一步研究发现FFCDs对糖酵解的抑制作用可能是通过抑制某些糖酵解途径中的关键酶活性实现的。

综上，可能是食源性的原因，大部分FFCDs在质量浓度达到20 mg/mL的级别才表现出细胞毒性，而FFCDs的细胞毒性可能与食品原料、加工方法、剂量、受试细胞等因素有关，另外也不排除研究人员操作与分析不当等因素对实验的干扰。

4.6 体内毒性

体外细胞实验由于与体内活体环境差别巨大，难以反映生物体内真实存在的复杂生理环境，而直接进行人体实验则存在伦理等问题，因此可采用诸如线虫、小鼠、大鼠、斑马鱼、果蝇等动物模型来评估FFCDs的体内毒性，常见的动物毒理学评价实验主要包括急性、亚急性和长期毒性实验等。

Li Shen等用来自于可乐中的FFCDs灌胃BALB/c小鼠，在单次口服2 g/kg剂量的内源性纳米粒子24 h后，未观察到小鼠死亡或明显的临床毒性迹象，并通过HE染色对小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、胃、小肠、结直肠、卵巢和睾丸等主要器官进行了病理学分析，结果显示小鼠无明显的器官损伤和组织病理学异常，且各项生化指标在生物学上没有显著差异。Wang Haitao和Song Yukun等采用类似的方法分别研究了来自雪花啤酒和烤三文鱼的FFCDs对小鼠的急性口服毒性，同等实验剂量下，小鼠无明显的体质量变化、死亡或临床毒性迹象，谷丙转氨酶、天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、尿素和肌酐水平等生化指标以及组织病理学结果皆没有发生明显变化。综合上述结果，2 g/kg的剂量FFCDs对小鼠无急性毒性。

Zhao Xue等将烤猪肉中的FFCDs掺杂在大肠杆菌OP50中，经喂食野生型秀丽隐杆线虫后发现，高质量浓度FFCDs对秀丽隐杆线虫的体长、虫卵体积、移动行为、身体曲度、头部抽动和爬行频率等指标均产生明显的负面作用。当暴露在质量浓度超过5 mg/mL的FFCDs时，线虫寿命明显缩短。

毕景然以斑马鱼为模式动物，对来源于烤海鳗鱼的FFCDs的急性、亚急性和长期毒性进行了研究。急性毒性实验结果表明FFCDs处理斑马鱼96 h后的半致死浓度为321.951 mg/L，属于低毒性。亚急性毒性实验结果表明，高质量浓度（65 mg/L）FFCDs处理14 d会导致ROS水平上升，进而造成一定的氧化损伤，而低质量浓度或处理时间短则变化不明显。在30 d的长期毒性实验中发现，同样只有高质量浓度（30 mg/L）FFCDs处理会诱导ROS水平上升和氧化损伤。

因而，大部分FFCDs对动物无明显的急性毒性，这可能与FFCDs与血液中形成蛋白冠有关系，但从长期摄入角度来说，FFCDs在体内的代谢可能存在时间累积效应，而目前鲜见FFCDs有关遗传或长期毒性等的报道。

5 结 语

FFCDs是在加工食品中普遍存在的，具有高比表面积、较优的荧光稳定性以及丰富的表面官能团，对DPPH自由基、羟自由基清除等方面的抗氧化效果也较显著。FFCDs能随食物进入人体胃肠内被消化吸收进入血液，分布到机体的脑等重要器官，最终可能经代谢排出体外。从细胞实验结果来看，FFCDs的细胞毒性与食品原料、加工方法、浓度剂量、受试细胞等因素密切相关；而动物实验结果表明FFCDs（2 g/kg的剂量）对小鼠无明显急性毒性，但遗传或长期毒性现在还不得而知。迄今为止，关于FFCDs的形成机制、荧光发光机理、被细胞摄取与转运机制以及生物效应调控等难题还没有确切的答案。深入了解这些问题对FFCDs在食品加工领域安全控制和人类健康都具有重要的意义。