茶多糖-茶多酚对小鼠肠道氧化应激的改善与作用机制

韦 铮，贺 燕，黄先智，沈以红，丁晓雯,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400700；2.西南大学科技处，重庆 400700）

不良饮食、环境等多方面因素的影响会导致机体内氧化还原系统失衡。-半乳糖是经典的氧化应激造模剂，该物质经醛糖还原酶作用形成半乳糖醇，在体内堆积而导致机体产生过多的活性氧（reactive oxygen species，ROS），从而引起机体出现氧化应激反应，过量的ROS不仅会诱导机体内生物大分子损伤，而且会引起糖尿病、白内障等并发症的发生。Toll样受体4（toll-like receptors，TLR4）/p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）/核因子-E2相关因子（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路是机体内主要的抗氧化信号通路，TLR4是微生物成分引起树突细胞活化的桥梁，p38 MAPK是MAPK的亚类之一，p38 MAPK通路在ROS的作用下被激活，磷酸化形成p-p38，进一步刺激Nrf2与Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）分离，Nrf2进入细胞核后与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）相结合，激活抗氧化酶系统和谷胱甘肽氧化还原系统。这两个系统的存在能够清除机体产生的ROS，以防止ROS对机体细胞产生损伤，保持机体氧化还原平衡，免受氧化应激损害。

茶是我国最普遍的饮品之一，其含有的活性成分茶多酚具有降血糖、调节免疫、抗氧化等功能，该物质是茶叶中研究最多的成分。茶多糖是茶叶的另一活性成分，是一种与蛋白质、大量矿质元素结合的酸性糖蛋白。现有研究证明茶多糖也具有类似茶多酚的功效，本实验室前期已通过体外实验证明，本实验所用茶多糖-茶多酚混合功能成分（tea extract rich in polysaccharides and polyphenols，TEPP）具有抗氧化作用，但是该物质对肠道氧化应激损伤是否具有改善作用与机制的研究相对较少。本实验主要通过给小鼠腹腔注射-半乳糖以建立肠道氧化应激损伤模型，然后灌胃不同剂量的TEPP，从TLR4/p38 MAPK/Nrf2信号通路（图1）角度探究TEPP对-半乳糖诱导的小鼠肠道氧化应激的改善作用与机制。如今，消费者对于天然抗氧化剂的需求逐渐提高，茶多糖-茶多酚作为天然成分，对其相关功能的研究将为产品的开发以及机体抗氧化机理等提供理论依据。

图1 TLR4/p38 MAPK/Nrf2通路[13-15]Fig.1 TLR4/p38 MAPK/Nrf2 pathway[13-15]

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

基础饲料，SPF级昆明种小鼠（雄）84只，4 周龄，平均体质量为20 g左右，由重庆医科大学实验动物中心（生产许可证号：SCXK（渝）2018 0003）提供。TEPP购自湖南华城生物资源股份有限公司，经测定含56.9%（质量分数，下同）茶多糖、19.4%茶多酚、13.2%灰分、9.6%水分、0.1%蛋白质。

总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、ROS、GR、HO-1酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 上海优选生物科技有限公司。DNA ladder抽提试剂盒 上海碧云天生物科技有限公司；高纯总RNA快速提取试剂盒北京百泰克生物技术有限公司；反转录试剂盒、SYBR Premix ExTMII（Til RNaseH Plus）试剂盒 宝生物工程（大连）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Synergy H1型酶标仪 美国基因有限公司；T100T型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪美国Bio-Rad公司；qTOWER3G型实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）仪 德国耶拿公司；ALPAAI-4LSC型高速离心机 德国Christ公司；DHP-9082型恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司；5880 R型冷冻离心机 德国Eppendorf公司；DW-HL438型超低温冰箱 合肥美菱股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠的造模与分组

将84只昆明种雄性小鼠（体质量18～22 g）随机分笼（每笼3～4只）适应性饲养1 周，饲养条件：室温（温度（23f2）℃、相对湿度40%～60%），12 h光照（9∶00～21∶00）/12 h黑夜（21∶00～9∶00）昼夜交替，基础饲料，自由进食饮水。适应性饲养1 周后，用苦味酸标记小鼠，分出12只作为正常组，腹腔注射0.1 mL/10 g生理盐水；剩余的小鼠每天同一时间段腹腔注射0.1 mL/10 g的质量分数10%-半乳糖（用0.9%灭菌生理盐水配制）进行造模，自由进食饮水。连续注射45 d后颌下取血，测定造模组和正常组小鼠血清的丙二醛（malondialdehyde，MDA）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、-乳酸（-lactic acid，-LAC）含量是否存在显著性差异，如果存在，表示造模成功，不然继续注射直到造模成功，以一周为周期进行造模判断，然后进行后续实验。

将小鼠分成未经过造模的正常组（灌胃生理盐水）和造模成功的模型组（灌胃生理盐水）、阳性对照组（灌胃200 mg/kg还原型谷胱甘肽）、茶多酚组（灌胃50 mg/kg茶多酚，该剂量与高剂量组的茶多酚含量相同）、低剂量组（灌胃40 mg/kgTEPP）、中剂量组（灌胃100 mg/kgTEPP）、高剂量组（灌胃250 mg/kgTEPP）。对所有小鼠进行为期45 d的灌胃，每天同一时间段灌胃1 次，灌胃体积为0.1 mL/10 g。

1.3.2 实验样本的采集与制备

灌胃45 d后，小鼠禁食不禁水12 h，摘眼球取血，取血后的小鼠颈椎脱位处死，打开腹腔，取肠道，用冰冷的生理盐水冲洗去除其表面血水，取出结肠的肠道内容物，液氮速冻，于－80 ℃冰箱中保存备用。切取空肠用锡箔纸包好放在－80 ℃的冰箱中保存，以上操作均于无菌操作台中进行。

肠组织按照试剂盒说明书上的方法，以（脏器）∶（生理盐水）=1∶9的比例加入生理盐水用匀浆机均浆，－4 ℃、3 000 r/min离心20 min，取上清液于－80 ℃保存备用。

1.3.3 空肠组织中T-AOC、ROS浓度、GR活力、HO-1活力的测定

均按ELISA试剂盒说明书的方法进行测定。

1.3.4 空肠组织中、、、、mRNA表达量的测定

按照RNA提取试剂盒提供的方法提取空肠组织总RNA，再根据反转录试剂盒说明书提供的方法将RNA反转为cDNA，再进行PCR扩增。取上述反转录产物1 μL作为反应模板、SYBR Green 5 μL、HO 5 μL、上游引物0.3 μL、下游引物0.3 μL，总体系11.6 μL，进行qPCR。引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，如表1所示。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

qPCR反应条件：95 ℃、4 min预变性；95 ℃、15 s变性，60 ℃、30 s退火，共39个循环。以-actin作内参基因，分别测定空肠组织中、、、、mRNA的相对表达量，结果以2表示。

1.4 数据处理与分析

实验结果用平均值±标准差表示，采用SPSS 25.0软件进行数据分析，数据采用单因素方差分析和邓肯检验进行差异显著性分析（＜0.05为差异显著），使用Prism 8软件作图。

2 结果与分析

2.1 TEPP对实验小鼠空肠组织T-AOC、ROS浓度的影响

T-AOC用于判断机体总抗氧化能力，同时也是全面反映酶和非酶抗氧化物的抗氧化能力的一个指标。高浓度的ROS会引起氧化应激反应，影响细胞核的形态和大小，损伤DNA碱基片段，导致细胞死亡。不同剂量的TEPP对实验小鼠肠道T-AOC、ROS浓度的影响见图2。

图2 TEPP对小鼠肠道T-AOC（A）、ROS浓度（B）的影响Fig.2 Effect of TEPP on T-AOC (A) and ROS content (B) in the intestine of mice

由图2可知，相比正常组，模型组小鼠肠道T-AOC下降了43.1%（＜0.05），ROS浓度升高了96.9%（＜0.05），说明模型组小鼠体内氧化还原平衡受到破坏，造模是成功的；阳性组T-AOC、ROS浓度恢复到了正常水平（＞0.05）；与模型组相比，茶多酚组的T-AOC上升了54.6%，ROS浓度降低了56.6%；高剂量组的T-AOC质量浓度上升了约2.2 倍，ROS浓度降低了72.8%，其余各剂量的TEPP也均使T-AOC有所上升而使ROS浓度降低，有明显的改善氧化应激损伤的作用。与茶多酚组相比，高剂量组的T-AOC上升了47.1%，ROS浓度降低了37.3%，低、中、高剂量组之间的T-AOC和ROS浓度均存在显著性差异（＜0.05），说明TEPP能够提高小鼠肠道总抗氧化能力，降低ROS浓度，缓解氧化应激反应。

2.2 TEPP对实验小鼠空肠组织中GR、HO-1活力的影响

Nrf2/ARE是重要的内源性抗氧化信号传导通路，其下游信号包括两个氧化还原系统。HO-1是抗氧化酶系统中的一员，是机体内抗氧化防御和调节铁平衡的关键物质；GR是谷胱甘肽氧化还原系统的一员，通过将氧化型谷胱甘肽转变成还原型谷胱甘肽而参与机体氧化应激损伤的调节。不同剂量的TEPP对实验小鼠肠组织GR、HO-1活力的影响结果见图3。

图3 TEPP对小鼠肠道GR、HO-1活力的影响Fig.3 Effect of TEPP on GR and HO-1 activity in the intestine of mice

由图3可见，与正常组比，模型组的GR、HO-1活力分别降低了48.3%、43.1%（＜0.05），说明氧化应激损伤了小鼠空肠组织的氧化还原调节系统；阳性组的上述指标恢复至正常水平（＞0.05）。与阳性组相比，茶多酚组的GR、HO-1活力分别升高了24.0%、9.6%（＜0.05）；高剂量组的GR、HO-1活力分别约为正常组的2 倍和1.5 倍（＜0.05），Zhao Yi等探究了铁皮石斛多糖（dendrobium officinale polysaccharides，DOP）的抗氧化和胃癌预防作用，结果显示与正常组比，9.6 g/kg高剂量的DOP使机体Nrf2、HO-1蛋白表达量增加了约2 倍，证明了DOP能够通过激活Nrf2途径和HO-1起到抗氧化作用，与本实验结果一致。

与模型组相比，茶多酚组的GR、HO-1活力分别上升了约1.5、0.9 倍（＜0.05）；高剂量组的上述指标分别上升了约2.8、1.7 倍（＜0.05），相较于茶多酚组分别升高了51.4%、39.5%（＜0.05），表明实验剂量范围内，TEPP更能提升肠道抗氧化酶系统的活力。

2.3 TEPP对空肠组织TLR4、p38 mRNA表达量的影响

TLR4与炎性细胞因子和氧化应激密切相关，它通过MyD88和含Toll-白细胞介素1受体域的衔接子诱导干扰素-β启动细胞内信号转导，并被认为是多种疾病的调节剂。p38为MAPK的亚单位，磷酸化产物可激活Nrf2-keap1的解离，进一步激活Nrf2/ARE通路及其下游信号。不同剂量的TEPP对实验小鼠空肠组织、mRNA表达量的影响结果见图4。

图4 TEPP对小鼠肠道中TLR4（A）、p38（B）mRNA表达量的影响Fig.4 Effect of TEPP on the mRNA expression of TLR4 (A) and p38 (B)in the intestine of mice

由图4可知，与正常组相比，模型组的mRNA表达量升高了26.0%，mRNA表达量升高了约1.5 倍（＜0.05），说明氧化应激反应激活了TLR4/p38通路；阳性组使、的mRNA表达量恢复到正常水平（＞0.05）；与正常组相比，高剂量组、的mRNA表达量分别降低了17.8%、51.2%（＜0.05）。Fan Jingjing等研究显示2 mg/mL的发酵人参以390 mg/（kggd）的剂量进行灌胃后，使小鼠肝脏组织中、mRNA表达量下降至正常组以下，表明发酵人参能够调控TLR4相关信号通路。本实验的研究结果显示，TEPP能减弱氧化应激导致的mRNA的高表达，抑制MAPK磷酸化，证明其能够通过TLR4/p38通路对氧化应激反应进行调节。

与模型组相比，茶多酚组、mRNA表达量分别降低了6.9%、28.8%（＜0.05），但未恢复到正常水平；高剂量TEPP可使、mRNA表达量分别降低39.1%、82.4%（＜0.05），低剂量TEPP对、mRNA表达量的影响与茶多酚组之间无显著性差异（＞0.05）；中剂量、高剂量组、mRNA表达量无显著性差异（＞0.05），说明在实验剂量范围内，TEPP对、mRNA表达量的抑制存在量-效关系，且剂量在100 mg/kg时，对、mRNA表达的抑制作用达到饱和。与茶多酚组相比，高剂量组、mRNA表达量分别降低了34.6%、75.3%（＜0.05），说明TEPP更能对TLR4/p38通路有抑制作用。

2.4 TEPP对空肠组织Nrf2、GR、HO-1 mRNA表达量的影响

通过触发其下游靶基因，激活下游氧化还原系统相关基因的表达，是各种抗氧化剂和抗炎细胞因子的主要调节剂基因。不同剂量的TEPP对实验小鼠空肠组织、、mRNA表达量的影响结果见图5。

图5 TEPP对小鼠肠道中Nrf2（A）、GR（B）、HO-1（C）mRNA表达的影响Fig.5 Effect of TEPP on the mRNA expression of Nrf2 (A), GR (B)and HO-1 (C) in the intestine of mice

由图5可见，与正常组对比，模型组、、的mRNA表达量分别降低了32.8%、77.1%、31.1%（＜0.05），说明氧化应激反应破坏了Nrf2及其下游氧化还原系统的平衡。阳性组使上述损伤恢复到了正常水平（＞0.05）；TEPP高剂量组的上述指标均高于正常组。Huang Qincheng等实验结果显示，95 mg/kg VE使机体肠组织中、mRNA表达量上升且超过正常组，证明VE是通过调节Nrf2途径来调节生物体氧化作用的，与本实验结果类似。

与模型组相比，茶多酚组、、的mRNA表达量分别升高了21.9%、1.2 倍、16.2%（＜0.05）；高剂量组的上述指标分别升高了83.6%、8.3 倍、96.3%（＜0.05）。与茶多酚组相比，高剂量组的、、mRNA表达量分别升高了50.6%、3.2 倍、69.0%（＜0.05），低剂量组与茶多酚组上述指标间无显著性差异（＞0.05），说明TEPP对肠道氧化应激反应的改善作用具有量-效关系，能通过调节Nrf2通路对-半乳糖引起的肠道氧化应激作用进行改善与修复。

3 讨 论

TLRs是模式识别受体之一，能够特异性识别信号分子，TLR4主要是内毒素的识别受体，两者相结合可启动下游信号，激活MAPK相关亚基的磷酸化，例如p38 MAPK的磷酸化能够在某种程度上反映机体氧化应激状态。Dong Na等研究显示黄氏多糖能够通过抑制内毒素刺激引起的p38 MAPK、ERK1/2 MAPK磷酸化来抑制趋化因子的产生，而改善空肠绒毛形态。氧化应激反应会引起肠道屏障损伤，导致大量肠道细菌和内毒素侵入组织和循环，促发各种肠道疾病。本实验研究结果同样证明，TEPP能够通过减弱mRNA的表达，抑制MAPK磷酸化来起到抗氧化作用。

Nrf2/ARE通路是机体内源性抗氧化防御机制之一，在稳态条件下，Nrf2与其抑制剂蛋白Keap1相互结合保留在细胞质中，当细胞受到应激反应时，Nrf2与Keap1发生解离，进入细胞核，与核内Maf蛋白形成二聚体后与ARE结合，转录活化下游包括HO-1的抗氧化酶系统和包括GR的谷胱甘肽氧化还原系统，抗氧化剂的存在能够上调下游信号物质。谷胱甘肽是细胞自卫过程中必不可少的一员，谷胱甘肽氧化还原系统对维持细胞氧化还原状态平衡起着至关重要的作用，保持机体内谷胱甘肽处于高水平，氧化型谷胱甘肽处于低水平，维持体内适当还原态环境。血红素对真核生物血红蛋白和肌红蛋白的氧结合过程以及细胞代谢至关重要。HO-1可将血红素代谢成胆绿素、一氧化碳和亚铁离子，可以在病理生理条件下保持细胞和组织的体内稳态。胆绿素及其还原产物胆红素对羟自由基、超氧阴离子自由基等自由基有一定的清除作用。Shan Yingying等研究表明五味子多糖能通过上调和下游基因表达，并下调表达，而抑制氧化应激作用，证明了其机制与Nrf2/ARE和TLR4的调节密切相关，本实验结果与此一致。

-半乳糖是现今较为公认的用于建立氧化应激模型的药物，本实验结果显示，实验所设计的剂量的TEPP能够提高肠组织T-AOC和GR、HO-1活力，降低ROS质量浓度，降低、mRNA的表达，提高、、mRNA的表达，证明了TEPP具有抗氧化作用，且对肠组织氧化应激反应具有改善作用，这种抗氧化作用主要是通过p38 MAPK/Nrf2途径实现的。同时，高剂量组与茶多酚组对比结果表明，在实验剂量范围内，TEPP的抗氧化效果优于茶多酚单独效果。结果为功能性食品的开发、化妆品的研发等提供部分理论依据，但在化妆品应用中需进一步对皮肤耐受等因素进行探究。现有研究显示茶多糖主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖等单糖构成，茶多酚主要化学成分为儿茶素类、黄酮类、花青素类、酚酸类4大类物质，茶叶种类、加工方式、提取工艺对茶多糖的组成结构、茶多酚的组成均存在影响，同时不同品种地区的茶叶、不同比例的茶多糖及茶多酚产生的降血糖功效强弱各不相同，本实验所用TEPP中茶多酚及茶多糖的具体组成结构及不同配比的茶多糖-茶多酚对肠氧化损伤改善效果仍需进一步研究。茶多糖、茶多酚存在降血糖血脂、改善炎症、调节肠道菌群、抗氧化等功效，本实验仅证明了在抗氧化方面，TEPP在实验剂量范围内略优于茶多酚，对其他功效是否具有相同效果及其是否会产生副作用仍需考证。且本实验所采用的并非纯品的茶多糖及茶多酚的混合物，因此，不同品种、不同加工方式、不同提取工艺、不同比例的混合物对于各功效的影响同样需要更深入的研究。

4 结 论

本实验结果显示，与模型组相比，TEPP高剂量组的T-AOC上升了约2.2 倍，GR、HO-1活力分别上升了约2.8、1.7 倍，ROS浓度降低了72.8%，、的mRNA表达量分别降低了39.1%、82.4%，、、的mRNA表达量分别升高了83.6%、8.3 倍、96.3%，且都存在显著差异（＜0.05），证明了在本实验剂量范围内，TEPP能够通过TLR4/p38/Nrf2通路改善-半乳糖诱导的小鼠肠道的氧化应激反应。