酶法合成sn-2位富含DHA的中长链结构脂

姜 萱， 杨 瑶, 徐秀丽， 晁仲昊， 张石群， 程 阳， 邹孝强

(江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)

二十二碳六烯酸(DHA)是大脑组织中常见的ω-3长链多不饱和脂肪酸(PUFA)，有多种药理与生理功能[1-6]。DHA是大脑生长和维持功能所必需的脂肪酸，对婴幼儿的神经、视力、大脑发育有着重要意义，但是婴儿内源性合成DHA不能满足自身生长发育需求，故需通过饮食补充DHA[7-8]。婴儿的消化系统发育不完善，其胃脂肪酶的水平虽然与成年人相似，但胰脂肪酶和胆盐的含量分别仅为成年人的5%～10%和50%，所以婴儿的每日脂肪摄入量虽然是成年人的3～5倍，但其消化能力有限，吸收率显著低于成人[7-8]。因此，提高DHA在婴儿体内的生物利用度非常重要。

中长中(MLM)型结构脂是最典型的中长链结构脂(MLSL)，即中链脂肪酸(MCFA)位于sn-1,3位，而长链脂肪酸(LCFA)位于sn-2位。人体内的胃脂肪酶和胰脂肪酶特异性作用于sn-1,3位，同时由于MCFA有良好的水溶性，在sn-1,3位的MCFA与LCFA相比更容易被水解，并经门静脉吸收后快速供能[9]；水解产生的sn-2位的单甘酯(MAG)富含LCFA，可通过肠壁快速吸收。因此，MLM型结构脂被认为是功能性脂肪酸的理想载体[10-11]。

有研究以商业真菌发酵的微生物油为原料，通过酶促酯交换及酸解反应，制备了富含PUFA的MLSL[12-15]。许多研究为提高反应速率选择反应温度40～60℃，在长时间的保温反应过程中PUFA较易发生氧化，丧失生物活性。同时，酶促酯交换反应的体系中不仅包含MLM型结构脂，还包含其他类型的MLSL及未反应的底物，MLM型结构脂分离困难；而酶促酸解反应中，sn-1,3位特异性脂肪酶对PUFA的活性较低，最终的产品中较多MLSL含有2个LCFA分子。因此，酯交换和酸解法难以获得高纯度的MLM型结构脂 。本研究在25℃下采用两步酶法制备富含MLM型结构脂的产品，减少了DHA在反应过程中的氧化，同时有效提高了产品中MLM型结构脂的含量。

本研究首先制备sn-2位富含DHA的MAG，随后通过脂肪酶催化其与癸酸(CA)的酯化反应获得MLM型MLSL。对酯化反应的除水方式，脂肪酶种类及添加量，底物摩尔比及反应时间对甘油酯组成的影响进行了考察，并对最终产物的组成进行了分析，以期为富含DHA的中长链结构脂的工业化应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

DHA藻油(来源于裂殖壶藻)，厦门汇盛生物有限公司；固定化脂肪酶Lipozyme RM IM(来源于Rhizomucormiehei)、Lipozyme 435(来源于Candidaantarctica)、Lipozyme TL IM(来源于Thermomyceslanuginosus)、Novozym 40086(来源于Aspergillusoryzae)，诺维信(中国)生物技术有限公司；无水乙醇(纯度≥99.5%)，上海麦克林生化科技有限公司；癸酸(纯度99%)，北京百灵威科技有限公司；正己烷、异丙醇，色谱纯，百灵威科技有限公司；2,7-二氯荧光素、正己烷、乙腈、乙酸、氯仿，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；4 Å分子筛，国药集团化学试剂有限公司；薄层色谱硅胶板(20 cm×20 cm，10 cm×20 cm)，乳山市太阳干燥剂有限公司；三油酸甘油酯标准品(纯度≥99%)、二油酸甘油酯混标(其中1,3-二油酸甘油酯含量为85%、1,2-二油酸甘油酯含量为15%)、2-油酸甘油酯(纯度≥95%)、1-油酸甘油酯(纯度≥99%)、37种脂肪酸甲酯混标，Sigma-Aldrich上海有限公司；DHA甲酯标准品溶液(9.99 mg/mL)，Supelco公司。

夹层反应釜；低温恒温槽；SHZ-3型循环水多用真空泵；Agilent 7820A气相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；Waters 1525高效液相色谱仪、Waters Acquity UPLC、Waters Xevo G2-S Q-TOF 质谱仪，美国Waters科技有限公司；Alltech 3300蒸发光检测器，美国Grace公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MAG的制备

参照文献[16]的方法进行MAG的制备。为了减少2-MAG发生酰基迁移，并防止PUFA氧化，DHA藻油的酶促醇解在25℃下进行。将DHA藻油和无水乙醇按照质量比1∶3混合，置于25 mL夹层反应釜中，添加10% Lipozyme 435，在350 r/min磁力搅拌下反应6 h，旋转蒸发除去体系中的乙醇，得粗产物。再采用溶剂进行萃取，具体为：取1 mL粗产物溶解在9 mL 95%乙腈中，用9 mL正己烷洗涤乙腈体系3次；取乙腈相，旋转蒸发除去溶剂后，溶于10 mL氯仿中，然后与10%乙醇溶液充分混合，分离后收集氯仿层，并用10 mL氯仿洗涤水相2次，合并氯仿层，旋转蒸发除去氯仿，得到MAG。

1.2.2 sn-2位富含DHA的中长链结构脂的制备

将1.2.1制备的MAG与CA以一定的摩尔比混合，添加一定量的脂肪酶，在25℃、350 r/min磁力搅拌、除水条件下进行反应，每隔一定时间取样，分析反应产物的甘油酯组成。

1.2.3 甘油酯组成分析

利用配有LiChrospher Si柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)的高效液相色谱(HPLC)和蒸发光散射检测器(ELSD)对中长链结构脂的甘油酯组成进行分析。HPLC条件：柱温30℃；ELSD温度55℃；流动相A为正己烷-异丙醇(体积比99∶1)，流动相B为异丙醇-正己烷-乙酸(体积比1∶1∶0.01)，流速为1.0 mL/min；梯度洗脱程序为流动相A在10 min内由100%线性降至80%，在10～14 min降至70%，随后在1 min内升至100%并保持5 min，总运行时间为20 min。采用峰面积归一化法进行定量。

1.2.4 甘油三酯(TAG)脂肪酸组成分析

取50 μL待测样品，采用薄层层析(TLC)将样品中的TAG分离，展开剂为正己烷-乙醚-乙酸(体积比80∶20∶1)[17]。在硅胶板上均匀喷洒0.2% 2,7-二氯荧光素乙醇溶液，在紫外光下显色，刮下对应TAG的条带，加入500 μL 2 mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，充分旋涡振荡后，用2 mL正己烷萃取脂肪酸甲酯2次，经无水硫酸钠柱干燥、氮气浓缩后，进行气相色谱分析。

气相色谱条件：SP-TM-380毛细管柱(60 m×0.32 mm×0.2 μm)；色谱柱升温程序为先在100℃下保持4 min，然后以15℃/min的速率升温到180℃并保持4 min，最后以4℃/min的速率升温至215℃；进样口温度和火焰离子化检测器温度均为250℃；载气为氮气，流速为1 mL/min；分流比100∶1。

通过与标准品的保留时间进行定性，通过峰面积归一化法进行定量。

1.2.5 sn-2位脂肪酸组成分析

将30 mg样品溶解于10 mL乙醚中，添加0.3 mL烯丙基溴化镁，剧烈搅拌1 min后，加入8 mL酸缓冲液(含0.27 mol/L HCl和0.4 mol/L硼酸)停止反应。除去水相，将乙醚萃取液用硼酸洗涤2次，并用无水硫酸钠干燥。采用氮气将乙醚相蒸发至150 μL，用氯仿-丙酮(体积比90∶10)为展开剂，在硼酸浸渍的TLC板上分离。将sn-2 MAG条带刮下，并用2 mL乙醚萃取2次，用无水硫酸钠干燥、氮气浓缩后进行甲酯化反应，采用气相色谱分析脂肪酸组成[18]。

1.2.6 酯化反应产物中TAG的纯化

参考Hita等[19]的方法对1.2.2得到的酯化反应产物中TAG进行分离纯化。将5.0 g酯化反应产物溶于125 mL正己烷，加入75 mL 0.8 mol/L KOH溶液(30%乙醇配制)，充分混合，游离脂肪酸及其钾盐溶于水相，TAG溶于有机相；两相分离后，用10 mL正己烷洗涤水相2次；合并有机相，旋转蒸发除去溶剂，得到纯化的TAG。

1.2.7 TAG构型分析

将1.2.6所得纯化的TAG用色谱纯正己烷配制成质量浓度为 0.5 mg/mL的溶液,进配备BEH C18 柱(2.1 mm×50 mm×1.9 μm)和四级杆飞行时间质谱仪的超高效液相色谱(UPLC)系统分析甘油三酯的构型。UPLC条件：进样量1.0 μL;柱温45℃；流动相 A为乙腈-异丙醇(体积比1∶9)，流动相 B为40%乙腈溶液，流动相中均加入10 mmol/L的乙酸铵;梯度洗脱程序为流动相A在0～1 min为70%，在1～30 min由70%线性升至87%，保持1 min，在31～32 min由87%线性降至70%，保持4 min;流速300 μL/min。MS条件：ESI 正离子模式；毛细管电压3.5 kV，锥孔电压30 V；离子源温度100℃；碰撞气体为氩气，流速50 L/h；脱溶剂温度400℃；去溶剂化气体为氮气，流速700 L/h；质量扫描范围(m/z)200～1 500。根据质谱信息对TAG构型进行准确定性，采用峰面积归一化法进行定量。

1.2.8 统计分析

所有样品测定均重复3次，数据由Microsoft Excel 2010和Origin 8.5软件计算得出，并以“平均值±标准差”表示。使用SAS软件对数据进行方差分析(ANOVA)。显著性水平为α=0.05，在p<0.05 时差异显著。

2 结果与讨论

2.1 MAG的甘油酯组成

DHA藻油经过醇解及溶剂萃取后，得到的MAG的甘油酯组成如图1所示。由图1可以看出，MAG中2-MAG含量为80.21%。

图1 MAG的甘油酯组成

2.2 M-DHA-M型MLSL制备的单因素实验

2.2.1 除水方式对酯化反应的影响

在MAG与CA的酯化反应中，及时从反应体系中除去副产物水，将大大提高产品中TAG的产率。在MAG与CA摩尔比1∶3、Lipozyme TL IM添加量为底物质量的10%、反应温度25℃条件下，考察不同除水方式对反应体系中TAG含量的影响，结果如图2所示。

由图2可以看出，常压下的反应体系反应24 h后，TAG含量均显著高于10 h时的，说明在10 h时酯化反应尚未达到平衡。在常压下，选用棍形分子筛+正己烷体系的TAG含量较高，反应24 h时TAG含量达到82.75%；而选用球形分子筛的反应中，在正己烷体系和无溶剂体系下反应24 h后，TAG含量分别达到75.04%和63.34%。在真空度0.05 MPa下的反应体系在5 h内TAG含量急剧上升，7 h后接近平衡，反应9 h时TAG含量达到97.48%,远高于其他3种除水方式的。有研究表明，正己烷作为溶剂会导致酰基迁移率上升[20]；而真空环境下，TAG积累速率更高，平衡条件下TAG含量更高，说明真空除水效率高，与文献[16]结果相符,且真空除水避免了溶剂对酰基迁移的影响。因此，选择0.05 MPa真空作为除水的最佳方法。

注：正己烷体系(正己烷体积为底物质量的4倍);球形分子筛和棍形分子筛添加量均为200 mg；分子筛在马弗炉中500℃下活化4 h

2.2.2 脂肪酶种类对酯化反应的影响

本研究采用固定化脂肪酶催化MAG与CA的酯化反应。Lipozyme TL IM、Lipozyme RM IM及Novozym 40086为特异性催化sn-1,3位的固定化脂肪酶，为了提高TAG的生产效率，比较了3种脂肪酶在酯化反应中的催化能力。在MAG与CA摩尔比1∶3、脂肪酶添加量为底物质量的10%、反应温度25℃、真空度0.05 MPa条件下，考察脂肪酶种类对反应体系中TAG含量的影响，结果如图3所示。

图3 脂肪酶种类对酯化反应体系中TAG含量的影响

由图3可以看出，使用不同种类的脂肪酶不会改变反应的平衡状态，但会影响反应效率，从而影响反应平衡所需时间。Lipozyme TL IM在反应5 h内表现出最强的催化活力，反应5 h时反应体系中TAG含量达到93.57%，而反应7 h时，Novozym 40086、Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM催化的反应体系中的TAG含量均接近96.50%。Lipozyme TL IM的价格相对其他2种脂肪酶更低。综合考虑经济性及催化性能，选择Lipozyme TL IM作为酯化反应的催化剂。

2.2.3 MAG与CA摩尔比对酯化反应的影响

在可逆反应中，底物摩尔比是影响反应平衡状态的重要因素，同时影响反应效率。在Lipozyme TL IM添加量为底物质量的10%、反应温度25℃、真空度0.05 MPa条件下，考察MAG与CA摩尔比对反应体系中TAG含量的影响，结果如图4所示。

图4 MAG与CA摩尔比对酯化反应体系中TAG含量的影响

由图4可以看出，反应9 h时，MAG与CA摩尔比为1∶2的反应体系中TAG含量为92.05%，而MAG与CA摩尔比为1∶3、1∶4及1∶5的反应体系中TAG含量均高于97%。随着MAG与CA摩尔比从1∶2增加到1∶3，酯化反应速率和平衡状态下TAG含量均有显著提升；MAG与CA摩尔比从1∶3增加到1∶5，反应速率和TAG含量提高幅度较小，表明CA足量时，其含量提升对反应速率及平衡状态的影响较小。但是CA的增加会导致体系中脂肪酸含量显著增加，促进氧化，且过量的脂肪酸会增加脱酸的成本，因此应选择脂肪酸含量更低的MAG与CA摩尔比[21]。综合考虑，选择MAG与CA摩尔比1∶3。

2.2.4 Lipozyme TL IM添加量对酯化反应的影响

在MAG与CA摩尔比1∶3、反应温度25℃、真空度0.05 MPa条件下，考察Lipozyme TL IM添加量对反应体系中TAG含量的影响，结果如图5所示。

由图5可以看出：Lipozyme TL IM添加量为10%时，反应体系中TAG含量在反应时间0～5 h时急剧上升，反应5 h达到91.36%，反应7 h后趋于稳定，达到96.56%；Lipozyme TL IM添加量4%、6%及8%的反应体系中TAG含量随反应时间延长不断上升，在反应9 h时分别达到88.95%、94.84%及96.55%。在4%～10%的范围内，反应速率随着Lipozyme TL IM添加量的增加而提高，这是由于Lipozyme TL IM添加量较低时，体系内酶的含量不足以满足底物的接触需求；随着Lipozyme TL IM添加量的增加，酶与底物接触频率增加，酯化反应速率提高。由于反应9 h时Lipozyme TL IM添加量为8%的反应体系与添加量为10%的反应体系中TAG含量接近，因此选择Lipozyme TL IM添加量为8%。

图5 Lipozyme TL IM添加量对酯化反应体系中TAG含量的影响

综上，通过单因素实验，得到酯化反应的最优条件为：反应温度25℃，MAG与CA摩尔比1∶3，脂肪酶Lipozyme TL IM添加量为底物质量的8%，真空度0.05 MPa，反应时间9 h。在优化条件下得到的产物中TAG含量为96.55%。

2.3 TAG的脂肪酸组成

对最优酯化条件得到的产物按1.2.4方法分离TAG，并测定其脂肪酸组成，同时与DHA藻油的脂肪酸组成进行对比，结果如表1所示。

由表1可知:DHA、棕榈酸(PA，C16∶0)及二十二碳五烯酸(DPA，C22∶5)是DHA藻油中的主要脂肪酸，含量分别为54.12%、25.72%及10.96%；而其sn-2位脂肪酸组成中，PUFA(包括DPA和DHA)总含量为87.86%，其中DHA含量为69.39%。TAG中总脂肪酸以癸酸和DHA为主，含量分别为40.27%和40.04%；与DHA藻油相比，TAG中DHA含量略有下降，棕榈酸含量显著下降，而癸酸含量显著提升。TAG中sn-2位的脂肪酸主要为DHA和DPA，含量分别为72.15%和14.73%，癸酸含量仅为3.17%，表明在优化条件下酰基迁移率低。与DHA藻油相比，TAG中sn-2位的DHA含量更高，原因可能是以下两点：一是脂肪酶对DHA的活性较低，在醇解制备MAG的过程中，倾向于水解具有较短碳链及低不饱和脂肪酸，对DHA有一定的富集效果；二是sn-2位上的部分脂肪酸，如棕榈酸及油酸，更容易发生酰基转移，从而导致sn-2位的DHA含量增加。

表1 原料及TAG的脂肪酸组成 %

2.4 产品的TAG构型

采用UPLC-Q-TOF-MS分离鉴定产品中的TAG构型，结果见表2。

表2 产品的TAG种类及含量

由表2可知:从产品中共分析出14个TAG母离子，从中鉴定出16种甘油酯，其中MLSL含量为99.14%，含有DHA的 MLSL含量为67.69%； DHA-CA-CA及DPA-CA-CA是产品中最主要的2种TAG，含量分别为54.78%及20.49%。

结合脂肪酸组成与甘油三酯的鉴定，可以认为产品中的主要成分是MLM型TAG，且富含CA-DHA-CA。

3 结 论

本研究以酶催化醇解DHA藻油(来源于裂殖壶藻)获得的sn-2位富含DHA的MAG为反应原料，以CA为酰基供体，通过脂肪酶催化酯化反应制备sn-2位富含DHA的MLSL。最优酯化反应条件为：MAG与CA摩尔比1∶3，反应温度25℃，脂肪酶Lipozyme TL IM添加量为底物质量的8%，真空度0.05 MPa，反应时间9 h。在最优条件下，酯化产物中TAG含量为96.55%，TAG的脂肪酸组成中，DHA占总脂肪酸的40.04%，占sn-2位脂肪酸的72.15%；纯化的产品中中长链结构脂含量为99.14%，含DHA的中长链结构脂含量为67.69%。该产品富含CA-DHA-CA，可从分子层面提升DHA的生物利用率，并应用于婴儿配方食品及功能性食品。