高产丁酸乳酸菌的筛选及调节免疫功能评价

张蕊，张琪，桑跃，张永祥，胡雅倩，龄南

（1.中国农业大学营养与健康系，北京 100190；2.甘肃农业大学食品科学与工程学院，兰州730070；3.南京卫岗乳业有限公司，南京 211102）

产丁酸细菌作为一类重要的肠道细菌，近年来引起许多研究者的关注[1]。据研究，人体内超过95%的丁酸在结肠内产生和吸收[2]，其能够使结肠细胞保持稳定[3]，可以调节肠道菌群失调和治疗肠易激综合征、抗生素相关性肠炎、急慢性腹泻等疾病[4]。

乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）是一类可利用碳水化合物发酵产酸的细菌的统称，其发酵可以产生乳酸、乙酸、双乙酰和丁酸等物质[5]。人体内的丁酸主要通过乳酸菌利用乳糖产生丙酮酸，在丁酰磷酸转移酶和丁酸激酶的作用下生成[6]。近年来研究表明，丁酸激酶可能是丁酸形成过程中的主要酶[7]。目前，多数研究都针对肠道菌群产丁酸的作用及机制[8]，进行乳酸菌产丁酸机制的研究。

本文采用PCR扩增目的基因的方法，从40株乳酸菌中筛选具有丁酸激酶的乳酸菌，并检测其发酵液中丁酸产量，进一步利用动物实验探究其对小鼠免疫功能的影响，为菌株的产品开发和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

40株实验菌株来自中国农业大学益生菌研究中心；健康的6～8周BALB/c雄性小鼠，18～22g：购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 试验仪器

基因扩增仪（德国Eppendorf AG）；HF90型CO2培养箱（美国NAPCO）；GC-8860气相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；M 200 PRO多功能酶标仪（瑞士Tecan）；DL-CJ-2ND1洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；HV-110高压灭菌锅（日本Hirayama）。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌菌种活化

无菌条件下，乳酸菌冻干粉菌种，接种于10mL脱脂乳中，充分振荡后，37℃静置培养，凝固后以5%的接种量接种于MRS培养基中继续培养传代。传代3次后，取第3代菌液4℃保存备用。

1.3.2 PCR扩增丁酸激酶

细菌试剂盒提取DNA，以引物F（5’-GCTCGCTCGTATCAGTGGTT-3’）、R（5’-CCATTTCTCCTGGTCGCACT-3’）进行PCR扩增。

PCR反应体系（25μL）：模板DNA1μL、上下游引物各1μL、Taq Mix 12.5μL、无菌水9.5μL。PCR反应程序：94℃预变性3min、94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min、72℃保持5min，30个循环。琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物。

1.3.3 气相色谱测定丁酸产量

菌种活化完成后，在无菌条件下，按照5%的接种量接于MRS培养基中，在MRS培养基中培养12h、18h、24h，取发酵液20μL，用50%硫酸和乙醚提取丁酸，以2-乙基丁酸为内标，进行气相色谱仪测定。

色谱条件：柱流量为1mL/min，FID检测器，检测器温度为250℃，进样量为1μL；升温程序如下：60℃保持4min，以6℃/min的速度升温至180℃，再以20℃/min的速度升温至200℃，保持5min。

1.3.4 实验动物分组

小鼠适应性喂养一周后，随机分成3组，空白对照组、乳酸菌（L-113）低剂量组（1×107CFU/只）和乳酸菌（L-113）高剂量组（1×109CFU/只），每组8只。试验组以设定菌液浓度连续灌胃45d。

1.3.5 动物免疫功能测定

1.3.5.1 脾淋巴转化实验

颈椎脱臼法处死小鼠，无菌取脾，制成浓度为1×106个/mL的脾细胞悬液。进行MTT试剂盒测定，酶标仪于450nm处测定吸光值。脾淋巴转化能力以加ConA（刀豆蛋白）孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。

1.3.5.2 迟发型变态反应（DHT）

灌胃结束后，用2%绵羊红细胞（Sheep red blood cell,SRBC）对小鼠进行腹腔免疫，每只鼠注射0.2mL（约1×108个SRBC），4d后，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20%SRBC，每只鼠20μL（约1×108个SRBC），24h后用游标卡尺测量左后足跖部厚度或肿胀度，同一部位测量三次，取平均值。

1.3.5.3 抗体生成细胞检测

灌胃结束后，用2% SRBC对小鼠进行腹腔免疫，每只鼠注射0.2mL（约1×108个SRBC），4d后，无菌取脾，制成浓度为5×106个/mL的脾细胞悬液。在50℃恒温试管中加入0.5mL/管的Hank，SA液（含0.5%琼脂糖）备用。试管中加入25μL脾细胞悬液和50μL 10%SRBC，混匀，37℃ CO2培养箱中培养2h，用SA缓冲液稀释补体，室温孵育4h，统计软件统计每孔溶血空斑数，以空斑数/106脾细胞表示。

1.3.6 血清溶血素的测定

灌胃结束后，注射2% SRBC对小鼠进行免疫，0.2mL/只，4d后，眼眶采血制备血清，试管中加入1mL用SA缓冲液稀释200倍后的血清，依次加入SRBC和补体。对照组试管中的血清以SA液代替。37℃水浴20min，离心10min（2000r/min），取上清液加入都氏试剂，对照空白中加10% SRBC和都氏试剂，混匀后在540nm处测定吸光度值。

血清溶血素HC50=（样品吸光度/SRBC半数溶血时吸光度）×200

1.3.7 NK细胞活性测定

用含10%胎牛血清RPMI-1640完全培养液调整脾细胞浓度为1×106个/mL做效应细胞备用；以YAC-1细胞作为靶细胞，将已传代的靶细胞用含10%胎牛血清RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度为1×104个/mL做靶细胞备用；效应细胞与靶细胞各100μL共同培养，WST-8试剂盒检测。

2 结果与讨论

2.1 丁酸激酶的PCR扩增

丁酸激酶目的片段在600bp左右，对40株乳酸菌进行PCR扩增，将扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到一株含有目的基因的副干酪乳杆菌L-113。结果如图1所示。

图1 目的基因检测电泳图

2.2 丁酸产量的测定

将L-113接入MRS培养基中发酵，分别取12h、18h、24h发酵液用GC测定其丁酸产量，结果如图2所示，可以看出随着发酵时间的增加，丁酸产量呈上升趋势，发酵24h时，丁酸产量最高，可达5.8g/L。高文文等的研究发现一株高产丁酸的丁酸梭菌24h发酵液中丁酸含量为2.1g/L左右[9]，L-113丁酸产量约是它的3倍。

图2 L-113丁酸产量图

2.3 动物免疫功能测定

2.3.1 脾淋巴细胞转化

ConA刺激脾淋巴细胞中的T细胞增殖，增殖程度反映了T细胞的活性，是重要的细胞免疫指标。脾淋巴细胞转化结果见图3。灌胃低剂量与高剂量L-113的小鼠脾淋巴细胞增值能力均高于对照组，其中L-113高剂量组与对照组差异显著。而L-113低剂量组小鼠脾淋巴细胞增殖能力虽高于对照组，但无显著差异。

图3 小鼠脾淋巴细胞转化结果

2.3.2 迟发型变态反应

SRBC刺激T淋巴细胞成致敏淋巴细胞，4d后再以SRBC攻击时，攻击部位出现肿胀，肿胀程度反应迟发型变态反应程度，是细胞免疫功能的重要测定指标。经SRBC攻击前后小鼠足趾厚度差见图4。图中显示，两个剂量组小鼠足跖变态反应均高于对照组，L-113低剂量组、高剂量组与对照组之间均有显著差异。

图4 小鼠迟发型变态反应实验结果

2.3.3 抗体生成细胞检测

由B细胞介导的体液免疫是评价机体调节免疫能力的重要组成部分，抗体生成细胞是体液免疫能力检测重要的指标之一。用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素），利用其凝集SRBC的程度来检测溶血素的水平。

如图5所示，L-113低剂量组与高剂量组的抗体生成细胞数显著高于对照组，说明L-113能增加抗体生成细胞数含量。

图5 抗体生成细胞检测

2.4 血清溶血素测定

用SRBC免疫动物后产生溶血素，其含量表示血清中产生抗体的能力，反映动物的免疫能力。如图6所示，与对照组相比，低、高剂量干预组小鼠的HC50值有上升趋势但无显著差异，表明灌胃L-113的小鼠产生抗体的能力没有显著升高。

图6 血清溶血素测定

2.5 NK细胞测定

NK细胞是没有T和B细胞表面标志的淋巴细胞，具有非特异性杀伤作用，其增殖情况能反映动物的免疫能力。由图7可知，灌胃L-113两个剂量组的小鼠NK细胞活性均高于对照组，且两个剂量组均与对照组有显著差异，表明L-113具有增强NK细胞活性的能力。

图7 NK细胞活性测定

3 结论

丁酸激酶作为丁酸产生过程中的关键酶，其调控基因起到了重要作用，因此本试验以PCR扩增丁酸激酶基因片段作为筛选高产丁酸的乳酸菌的方法，筛选的40株乳酸菌中有一株副干酪乳杆菌L-113在600pb左右得到特异性目的条带。L-113在MRS培养基中发酵24h后的丁酸产量为5.8g/L。动物实验结果显示，灌胃L-113能显著增强细胞免疫（包括脾淋巴细胞转化能力和迟发型变态反应）、体液免疫（包括抗体生成能力）、NK细胞活性等免疫功能。本研究可为菌株在功能性产品中的应用提供理论依据。