蛇葡萄素通过核转录因子-κB通路调控黑色素瘤A375细胞周期和凋亡

蔡美红，刘向东，龙剑文

（1.武汉市武昌医院，湖北 武汉 430063；2.湖北中医药大学，湖北 武汉 430061）

黑色素瘤是常见的皮肤肿瘤，并以其较高的转 移率，死亡率和治疗抵抗而闻名[1]。早期黑色素瘤可以通过手术切除，患者存活率较前提高，且随着新型靶向治疗药物和免疫治疗方法的开发，晚期黑色素瘤的疗效也有明显改善[2]，但转移性黑色素瘤患者的总体预后仍然较差[3]。因此，有必要为临床研究寻找新的潜在治疗药物。蛇葡萄素，又称二氢杨梅素，是一种黄酮类化合物，从蛇葡萄茎叶中分离得到，有多种药理特性，如抗氧化、抗炎、抗疲劳、抗癌[4]，见图1A。最近的研究表明，蛇葡萄素可以抑制乳腺癌和结肠癌细胞增殖[5-6]。但是，蛇葡萄素对人黑色素瘤细胞增殖，细胞周期和凋亡的影响及机制目前尚不清楚。本文研究了蛇葡萄素对人黑色素瘤A375细胞增殖，细胞周期和凋亡的影响，探讨利用蛇葡萄素治疗人黑色素瘤的可能机制。

图1 蛇葡萄素的结构式及对A375细胞增殖和NF-κB通路的影响

1 材料与方法

1.1 实验材料 蛇葡萄素（纯度>98%）购自广州伟伯科技有限公司。实验用抗体主要有Bax抗体、Bcl-2抗体、Cleaved-caspase-3抗体、Cyclin D1抗体、CDK4抗体、NF-κB 抗体、p65抗体、IκBα 抗体、p-IκBα 抗体均购自美国Cell Signal Technology公司。PMA购买于Santa Cruz Biotechnology公司。Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒购置于美国BD公司。荧光显微镜购置于日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取人黑素瘤A375细胞，于37℃、5% CO2，在含有 10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）及链霉素（100 mg/L）的DMEM培养液中培养，胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。正常黑素细胞取自于健康男性包皮[7]，在含有细胞生长添加成分（HMGS）的M254培养基中培养，采用钙离子结合蛋白S100免疫组化染色法，证实其纯度超过95%。

1.2.2 蛇葡萄素对正常黑素细胞生长的影响 正常黑素细胞消化后，按5×104/孔接种于96孔板中，培养24h，实验分为只含有培养基和CCK-8的空白组、终浓度分别为 0（对照组）、5、10、25、50、100 μmol/L蛇葡萄素组，每组6孔，培养48 h后，加入八肽胆囊收缩素（CCK-8）10 μL，待培养液显色后，用酶标仪测各孔450 nm波长的吸光度，以细胞的存活率代表细胞的增殖程度。计算公式为：细胞的存活率（%）=[（A1-A3）/（A2-A3）]×100%。A1：实验组；A2：对照组；A3：只含有培养基和CCK-8空白组。

1.2.3 蛇葡萄素对人黑色素瘤A375细胞增殖的影响 取对数生长期A375细胞消化后，于96孔板中培养 24 h，实验分为 0、25、50、100 μmol/L 蛇葡萄素组及100 μmol/L蛇葡萄素组+200 nmol/L PMA组，各组培养48 h后，加入CCK-8 10 μL，待培养液显色，用酶标仪测各孔450 nm波长的吸光度。

1.2.4 Hoechst 33258荧光法检测细胞凋亡形态变化 将5×104/L人黑色素瘤A375细胞接种在6孔板（每孔 2 mL）中培养 24 h 后，实验分为 0、25、50、100 μmol/L蛇葡萄素组及100 μmol/L蛇葡萄素组+200 nmol/L PMA组。在37℃下，各组培养48 h后，磷酸盐缓冲液（PBS）洗2遍，然后用4%甲醛固定10 min，PBS洗涤细胞，在37℃下，用Hoechst 33258（10 mg/L）染色1 h，然后进行荧光显微镜检查。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 实验分为0、25、50、100 μmol/L 蛇葡萄素组及 100 μmol/L 蛇葡萄素组+200 nmol/L PMA组，细胞处理48 h后，1 000转/min（半径为20 cm）离心5 min后弃上清液，室温下PBS洗涤2次，收集细胞，加入结合缓冲液，重新悬浮细胞，调整细胞浓度。随后，添加5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，并在黑暗中培养 15 min，于 1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6 流式细胞仪检测A375细胞周期变化 人黑色素瘤A375细胞以5.0×104/L的浓度接种在6孔板中，然后隔夜培养。实验分为 0、25、50、100 μmol/L蛇葡萄素组及100 μmol/L蛇葡萄素组+200 nmol/L PMA组，37℃，继续培养48 h。收集细胞，并用预冷PBS洗涤2次。4℃，在70%乙醇中固定过夜，并用PI和 RNase A 溶液（5 μg/mL PI和 0.5 μg/μL RNase A）避光染色30 min后，流式细胞仪测定细胞DNA含量。

1.2.7 蛋白质印迹法（Western blotting，WB）检测蛋白含量 实验分为 0、25、50、100 μmol/L 蛇葡萄素组及100 μmol/L蛇葡萄素组+200 nmol/L PMA组，37℃，细胞培养48 h，收集细胞，PBS洗涤，冰上裂解 30 min，4℃ 12 000转/min（半径 20 cm）离心20 min，收集上清并用BCA法定量。用10%SDSPAGE分离蛋白并转移到PVDF膜上，PBS洗膜，5%脱脂牛奶在室温下封闭l h。在4℃下用一抗体孵育过夜，随后，用PBS洗涤膜3次，并加入HRP结合的二抗在室温下孵育2 h；洗膜；使用化学发光凝胶成像系统显示蛋白质条带，并使用Image Pro Plus 6.0软件进行定量分析。以β肌动蛋白为内参校正。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示。多组均数比较采用单因素方差分析。组间多重比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蛇葡萄素对正常黑素细胞增殖的影响 对照组黑素细胞存活率为（97.78±2.27）%，5、10、25、50、100 μmol/L 蛇葡萄素组分别为（97.01±1.20）%、（97.56±1.75）%、（97.52±2.59）%，（96.23±2.07）%、（95.46±2.42）%，6组存活率差异无统计学意义（F=1.12，P>0.05）。因此选定蛇葡萄素的工作浓度为25、50、100 μmol/L，对照组浓度为 0 μmol/L。

2.2 蛇葡萄素对A375细胞增殖的影响 不同浓度蛇葡萄素组中，A375细胞存活率组间差异有统计学意义（F=174.57，P<0.01），正常对照组 A375 细胞存活率高于 25 μmol/L蛇葡萄素组、25 μmol/L蛇葡萄素组高于50 μmol/L蛇葡萄素组、50 μmol/L蛇葡萄素组高于100 μmol/L蛇葡萄素组，差异有统计学意义（q=12.40、23.78、29.98，P<0.05）。但加用 NF-κB通路的活化剂200 nmol/L佛波醇脂（PMA）处理后，与100 μmol/L蛇葡萄素组组比较，A375细胞存活率明显提高（q=12.26，P<0.01）。见图1B。

2.3 蛇葡萄素抑制了NF-κB通路的活化 与正常对照组比较，在A375细胞中，各浓度蛇葡萄素呈剂量依赖性地提高了 IκBα 的表达（q=8.08、24.80、54.83，P<0.01），但显著抑制了 p-IκBα 的表达（q=20.15、37.36、54.16，P<0.05）。 p65 在胞浆中的表达升高（q=8.94、15.72、22.57，P<0.01），而核内表达明显降低（q=13.26、24.90、33.47，P<0.05），说明蛇葡萄素抑制了p65向细胞核的转移。但加用NF-κB通路的活化剂200 nmol/L PMA处理后，与100 μmol/L蛇葡萄素组组比较，A375细胞内IκBα的表达明显下降（q=50.19，P<0.01），p-IκBα 的表达明显提高（q=22.75，P<0.01），p65 在胞浆中的表达降低（q=14.77，P<0.01），而核内表达增加（q=14.90，P<0.05），说明PMA削弱了蛇葡萄素对NF-κB信号通路的抑制作用，见图1。

2.4 蛇葡萄素通过抑制NF-κB通路信号通路的活化诱导A375细胞凋亡 Annexin V/PI双染法结果显示，用不同浓度蛇葡萄素（终浓度分别为25，50，100 μmol/L）处理 A375 细胞 48 h 后，细胞总凋亡率分别为 （16.76±1.92）%、（30.04±2.28）%、（40.72±2.18）%，同正常对照组（7.21±1.42）%比较，组间差异均有统计学意义（F=332.61，P<0.01），加用200 nmol/L PMA处理后，细胞总凋亡率为（19.73±2.59）%，较100nmol/L蛇葡萄素组明显降低（q=24.32，P<0.01）。见图2A、C。同时，WB检测了各浓度蛇葡萄素对A375细胞内凋亡相关蛋白表达的影响，结果表明各浓度的蛇葡萄素增强了Cleaved-caspase-3和 Bax 的表达（F=73.96，P<0.01；F=54.78，P<0.01），而降低了凋亡抑制蛋白B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）的表达（F=82.87，P<0.01），而与 100 μmol/L 蛇葡萄素组比较，200 nmol/L PMA处理抑制了蛇葡萄素的上述效应（q=15.19，P<0.01；q=14.59，P<0.01；q=6.83，P<0.01）。见图2D、E。

图2 蛇葡萄素通过抑制NF-κB通路信号通路的活化诱导A375细胞凋亡

2.5 观察A375细胞凋亡形态 经Hoechst 33258染色后，正常对照组中的A375细胞饱满，呈现均匀蓝色荧光；而在各浓度蛇葡萄素处理组中细胞明显皱缩，细胞核中可见浓染的荧光颗粒。见图2B。

2.6 蛇葡萄素通过抑制NF-κB信号通路阻滞A375细胞周期于G0/G1期 不同浓度蛇葡萄素组中，人黑色素瘤A375细胞G0/G1期细胞比例差异有统计学意义（F=62.10，P<0.01）。正常对照组细胞G0/G1期比例低于25 nmol/L蛇葡萄素组、25 nmol/L蛇葡萄素组明显低于50nmol/L蛇葡萄素组、50nmol/L蛇葡萄素组明显低于100 nmol/L蛇葡萄素组，差异均有统计学意义（q=5.11、11.83、18.08，P<0.01）。而与100 nmol/L蛇葡萄素组比较，200 nmol/L PMA处理削弱了蛇葡萄素对A375细胞细胞周期的抑制作用（q=10.46，P<0.01）。见图3A、B。同时，笔者进一步检测了蛇葡萄素对细胞周期调节蛋白Cyclin D1和CDK4的表达。结果表明，与正常对照组比较，各浓度蛇葡萄素明显抑制了 CyclinD1（F=207.57，P<0.01），CDK4（F=301.07，P<0.01）的表达，而与 100 nmol/L蛇葡萄素组比较，200 nmol/L PMA处理削弱了蛇葡萄素对Cyclin D1和CDK4表达的抑制作用（q=5.71，P<0.01；q=8.06，P<0.01），见图3C、D。

图3 蛇葡萄素通过抑制NF-κB通路信号通路阻滞A375细胞细胞周期于G0/G1期

3 讨论

恶性黑色素瘤有侵袭性，其发病率在过去30年中在世界范围内不断上升。尽管近年来在改善黑色素瘤预后方面做了很多努力，但即使经过积极治疗，黑色素瘤患者的长期生存机会仍然很低。对于Ⅳ期黑色素瘤患者，5年生存率只有9%～28%[8]。肿瘤转移和缺乏有效药物是导致总生存率低的主要原因。那么发现新的药物来抑制黑色素瘤细胞的增殖和转移已成当务之急。天然中草药有多种生物活性，是癌症治疗的常用药物[9]。蛇葡萄素是一种天然的黄酮类物质，存在于葡萄中，浆果、蔬菜、香草等植物中。蛇葡萄素有抗疲劳、抗炎、抗肿瘤、保肝、调节脂质代谢等生物活性[10]。在笔者研究的浓度范围内，蛇葡萄素对正常人黑色素细胞没有明显的细胞毒性。同时，笔者发现，蛇葡萄素在体外能显著抑制人黑色素瘤A375细胞系增殖，并通过抑制NF-κB通路的活化，促进细胞凋亡，诱导细胞周期G0/G1期阻滞。

NF-κB是一种核转录因子，与调控肿瘤细胞的多种生物学效应密切相关。NF-κB蛋白主要由异二聚体p50/p65构成。NF-κB通路活化主要通过磷酸化抑制分子IκBα，并导致其降解，进而释放胞浆二聚体NF-κB p65/p50[11]。NF-κB调节细胞功能最基本的亚单位是p65。在细胞信号转导途径中，NF-κB p65从细胞质转移到细胞核，产生生物学活性[12]。因此，检测NF-κB p65核蛋白可以指示NF-kB的活化程度。实验结果显示，蛇葡萄素明显促进了IκBα 的表达，明显降低了 p-IκBα 的含量，减少了NF-κB p65的核转位，抑制了人黑色素瘤A375细胞NF-κB通路的活化。

研究表明NF-κB通路活化能通过抑制细胞凋亡，促进肿瘤的发生[13]。而促进肿瘤细胞凋亡是一种治疗恶性肿瘤的有效手段。已经证实，抑制NF-κB通路的活化可以促进胃癌、甲状腺癌、乳腺癌等肿瘤细胞的凋亡[14-16]。Bcl-2蛋白家族，包括促凋亡蛋白（Bax）和抗凋亡蛋白（Bcl-2），在线粒体凋亡途径中发挥重要作用。线粒体Bcl-2/Bax蛋白比值对诱导肿瘤细胞凋亡有重要作用[17]。半胱氨酸蛋白酶家族能够促进肿瘤细胞凋亡[18]。Bax在细胞死亡刺激信号作用下向线粒体迁移，引发线粒体通透性转换孔相关事件的级联反应，导致线粒体膜电位下降[19]。而后，Caspase-9被激活，促进Caspase-3的活化，导致细胞发生凋亡[20]。在本研究中，蛇葡萄素促进了Cleaved-caspase-3和Bax的表达，而抑制了Bcl-2的表达，表明蛇葡萄素通过内源性途径促进人黑色素瘤A375细胞凋亡。

NF-κB能参与Cyclin D1等多种细胞周期蛋白的转录，进而调控细胞周期[21]。而细胞周期失调是肿瘤发生发展的重要因素，控制癌细胞的细胞周期过程是抑制肿瘤生长和发展的有效治疗策略。细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）与肿瘤细胞周期关系密切[22]。CDKs是细胞周期机制的重要调节因子，调节细胞周期从一个阶段向下一阶段的发展[23]。细胞周期蛋白和CDK活性异常可导致细胞程序性死亡的失调，有利于肿瘤细胞的选择性生长[24]。细胞周期蛋白D1作为G1检查点的关键介质，主要在G1期早期表达。而后，Cyclin D1/CDK4的活性复合体靶向视网膜母细胞瘤蛋白并将其磷酸化，从而释放可激活G1/S期基因表达的转录因子E2F，使细胞周期通过G1/S期[25]。在本研究中，蛇葡萄素通过抑制Cyclin D1和CDK4的表达，将细胞周期阻滞于G0/G1期。

综上所述，笔者证实了蛇葡萄素通过NF-κB通路调控黑色素瘤A375细胞周期和凋亡，抑制A375细胞增殖，为合理利用蛇葡萄素防治恶性黑色素瘤提供了依据。