粒毛盘菌YM156多酚对二乙基亚硝胺诱导肝损伤的保护作用

陈婷婷, 何雅玲, 叶红玲, 叶 明

(1.合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601; 2.安庆职业技术学院 农林与服装学院,安徽 安庆 246003)

肝脏疾病包括药物性肝损伤、酒精性肝损伤和肝癌等,是世界上发病率和死亡率较高的一类疾病,并给社会带来巨大的经济负担[1]。二乙基亚硝胺(NDEA)作为一种致癌物质,存在于生活的各个方面,如化妆品[2]、食品[3]、自来水[4]等。NDEA在体内可以引起氧化损伤、代谢紊乱、肝损伤等多种病理现象[5-6]。多酚作为一种具有抗氧化能力的次级代谢产物[7],其生物活性繁多,作为药物治疗肝脏疾病有一定的研究基础[8]。

粒毛盘菌属(LachnumRetz.)作为一种重要的真菌资源,生长周期短、易培养、代谢物种类多。有研究者从粒毛盘菌菌丝体及发酵液中提取出多种活性物质,如异香豆素衍生物[9]、多糖[10]以及多酚类化合物[11],并发现其多酚提取物具有抗凝血、抗氧化等作用[11-12]。但是,有关粒毛盘菌多酚对肝脏疾病是否具有预防或治疗作用的报道并不多。因此,本文对粒毛盘菌YM156进行深层发酵,利用70%的乙醇溶液提取菌丝体中的多酚类物质,并采用NDEA诱导昆明小鼠建立肝损伤模型,研究粒毛盘菌多酚对肝损伤的保护作用,为粒毛盘菌的利用与发展提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

粒毛盘菌(Lachnum)YM156采集和分离自中国黄山,并保存于合肥工业大学微生物资源与应用研究室。

1.2 YM156胞内多酚的发酵、提纯与测定

1.2.1 YM156胞内多酚的发酵

采用100 L全自动发酵罐进行深层发酵[13]。培养基配方为:20 g/L葡萄糖,5 g/L酵母膏,5 g/L蛋白胨,0.81 g/L MgCl2,0.01 g/L酪氨酸。首先对发酵罐进行清洁与灭菌,配置70 L的发酵液加入罐中,并加入消泡剂(50 mL色拉油)。于121 ℃再次灭菌20 min,冷却至30 ℃时接入菌种,发酵条件为:转速200 r/min,温度30 ℃,时间8 d。

1.2.2 YM156胞内多酚的提纯

粒毛盘菌YM156发酵结束后,对发酵液进行抽滤,收集菌丝体并在60 ℃的烘箱中干燥。将菌丝粉碎,70%乙醇浸泡提取4 h,离心、收集上清液,45 ℃旋转蒸发除去乙醇,重复3次。合并浓缩液真空冷冻干燥后,采用XAD-4型大孔树脂对粗提物进行纯化[14]。洗脱条件为:样品质量浓度为10 mg/mL,流速为2 mL/min,洗脱液为70%乙醇。收集洗脱液并除去乙醇,干燥后得到粒毛盘菌YM156多酚提取物(LSP156),并保存于-20 ℃冰箱。

1.2.3 YM156胞内多酚量的测定

采用文献[15]的方法测定LSP156中总酚的量,其中样品溶液质量浓度为1 mg/mL。可得回归方程为y=7.1x+0.043,R2=0.999。经测定,LSP156中总酚的量为85.9 mg/g。

1.3 肝损伤模型的建立及给药

采用清洁级昆明小鼠(雄性,20～22 g,40只),适应性喂养1周后,随机分为5组(n=8)[16]:对照组CG,NDEA模型组MG(150 mg/kg NDEA),单独LSP156组LG(100 mg/kg LSP156),低剂量组LL(50 mg/kg LSP156和150 mg/kg NDEA),高剂量组HL(100 mg/kg LSP156和150 mg/kg NDEA)。除了对照组和NDEA模型组外,其余3组小鼠每天灌胃0.2 mL的多酚溶液,持续28 d。在第29天,对照组和单独LSP156组腹腔注射0.1 mL的生理盐水,剩余3组注射0.1 mL的NDEA溶液(150 mg/kg),12 h后进行眼球取血,处死后解剖得到小鼠肝脏组织,生理盐水清洗并保存于-80 ℃冰箱。

1.4 生化指标测定

取出-80 ℃冰箱保存的小鼠肝脏,精确称取1 g肝脏,与9 mL生理盐水混合后匀浆并离心取上清,获得的10%肝组织匀浆备用。眼球取血30 min后,于3 000 r/min离心10 min,取上清液获得小鼠血清,于-80 ℃保存备用。

肝功能指标的测定。选取合适质量分数的肝脏组织匀浆,按照试剂盒说明书(南京建成生物科技有限公司)测定并计算谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(AKP)的活性。

氧化损伤指标的测定。首先进行预试验确定肝脏组织匀浆的最佳质量分数,采用商业试剂盒(南京建成生物科技有限公司)检测肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性。

血脂指标的测定。根据制造商(南京建成生物科技有限公司)的说明,通过测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)来检测和分析小鼠的脂质指标。

炎症反应指标的测定。使用ELISA试剂盒(合肥博美生物科技有限责任公司)测定小鼠血清中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的质量浓度。

肝脏匀浆中蛋白质的测定采用BCA法试剂盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.5 组织病理学测定

采用H&E染色法对小鼠肝脏组织进行染色并观察其病理学[17]。

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0进行数据分析,以(平均值±标准差)表示。组间分析采用One-way ANOVA检验,分析统计学意义。与对照组相比,*P< 0.05 具有显著差异;与NDEA模型组相比,#P< 0.05具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 LSP156对小鼠肝功能指标的影响

LSP156对小鼠体内AST、ALT和AKP酶活力的影响如图1所示。

图1 LSP156对小鼠体内AST、ALT和AKP酶活力的影响

从图1可以看出,与对照组相比,NDEA模型组小鼠肝脏中AST、ALT和AKP显著增高(P<0.05);在单独LSP156组中,AST、ALT和AKP没有显著变化;而经过LSP156预处理后,NDEA模型组小鼠肝脏中相关酶活性均有不同程度的降低。其中,与NDEA模型组相比,高剂量组中AST、ALT和AKP显著性降低,具有统计学意义(P<0.05)。这种变化与文献[18]研究结果相似。在机体中,ALT、AST和AKP是与肝脏代谢相关的细胞酶,当肝脏发生损伤时,这些酶的水平和活性受到影响[19]。在本研究中,LSP156的处理降低了小鼠肝脏中AST、ALT和AKP的活性,减轻了NDEA对小鼠肝脏的损伤,说明LSP156对肝脏具有较强的保护作用。

2.2 LSP156对小鼠体内抗氧化酶的影响

LSP156对小鼠体内抗氧化酶的影响如图2所示。由图2可知,与对照组相比,NDEA模型组中SOD和CAT降低,分别为17%和27%,说明NDEA会降低正常小鼠体内的抗氧化酶活性,引起氧化还原失衡,导致氧化损伤;而使用LSP156预处理后,单独LSP156组中抗氧化酶活性增加(无显著差异)。与NDEA模型组相比,100 mg/kg LSP156预处理的小鼠体内SOD增高,并具有统计学意义(P<0.05);而对于CAT,不同剂量的LSP156预处理能提高其酶活力,但不具有统计学意义。结果表明,LSP156能够增强体内抗氧化酶活性,维持氧化还原平衡,减少NDEA对小鼠的损伤。

图2 LSP156对小鼠体内SOD和CAT酶活力的影响

2.3 LSP156对小鼠体内TC和TG水平的影响

各组小鼠肝脏中TC和TG浓度的变化情况如图3所示。

图3 LSP156对小鼠体内TG和TC水平的影响

由图3可知,与对照组相比,NDEA模型组中TC和TG的水平显著升高,具有统计学意义(P< 0.05),表明小鼠急性肝损伤会导致肝脏内部TC和TG的蓄积;在低剂量和高剂量组中,LSP156降低了TC和TG的水平,并具有统计学意义(P< 0.05)。同时,单独LSP156组中脂质指标水平降低,说明LSP156对于小鼠的血脂水平具有改善作用。

2.4 LSP156对小鼠炎性因子的影响

炎症反应是机体中一种重要的防御机制,机体中炎症因子的大量产生会导致肝脏损伤。LSP156对小鼠体内IL-6和TNF-α水平的影响如图4所示。

图4 LSP156对小鼠体内IL-6和TNF-α水平的影响

从图4可看出,在NDEA模型组中,小鼠血清中IL-6和TNF-α的水平显著升高(P<0.05),说明NDEA刺激机体产生炎症反应;在低剂量和高剂量组中,LSP156的预处理降低了小鼠血清中IL-6和TNF-α的水平。结果表明，LSP156可以减轻NDEA诱导的肝脏炎性反应,从而对肝脏起到一定的保护作用。

2.5 LSP156对小鼠肝组织病理学的影响

NDEA不仅会导致肝功能受损,还会影响肝脏组织结构。肝组织学切片(放大400倍)如图5所示,图5中箭头所示为肝细胞体积增大,水样性变、核仁增多。

图5 肝组织学切片

由图5可知,对照组和单独LSP156组中小鼠肝脏结构正常,肝细胞排列紧密,界线明显,细胞核正常;NDEA模型组中出现肝细胞体积增大,水样性变,核仁增多,肝组织结构松散以及一些小灶性坏死。而LSP156的预处理减少了NDEA导致的肝脏组织病变,表明LSP156显著减轻了肝病损害。

3 讨 论

多酚类物质是自然界中最丰富的抗氧化剂,主要来源于水果、蔬菜以及一些真菌微生物等[20-21]。这些多酚类化合物可以通过不同的机制发挥其抗氧化性能,如清除自由基、改善内源性酶防御、降低脂质过氧化等[22]。众所周知,氧化过程与多种疾病有关,如神经退行性疾病、癌症、糖尿病、心血管疾病以及一些炎症疾病[23],这些均与多酚类化合物的生物学活性相关[24]。事实上,多酚类药物治疗肝脏疾病已有几十年的历史,并且有关体内外的研究也已经取得了振奋人心的结果。例如,槲皮素作为一种天然多酚类化合物,能通过抗氧化应激和抗炎作用保护肝脏免受CCl4诱导的损伤[25]。此外,多酚还可以通过多种分子机制预防甚至治疗肝癌[26]。

肝脏作为人体中最大的解毒和代谢器官,NDEA能够造成肝脏损伤[16]。在本研究中,LSP156能够减轻肝脏损伤,降低小鼠体内ALT、AST和AKP活性。有研究表明,NDEA能够导致机体中氧化还原反应失衡,减少抗氧化酶的水平[26],在机体中,SOD和CAT是2种重要的抗氧化活性酶,其中,SOD主要催化超氧阴离子自由基,而CAT催化过氧化氢,但超氧阴离子自由基和过氧化氢同属于活性氧(reactive oxygen species,ROS)。本文发现不同剂量的LSP156可以提高SOD和CAT的活性,抗氧化酶活性增加,从而降低活性氧水平,维持机体平衡。与此同时,本文还研究了小鼠体内TC和TG的水平。在机体中肝脏对脂肪、糖原等的运输和代谢尤为重要,而LSP156则缓解NDEA导致的脂质代谢紊乱[27]。此外,LSP156还降低了肝损伤小鼠血清中IL-6和TNF-α的质量浓度。机体中,IL-6和TNF-α是2种重要的细胞因子,在炎症、细胞免疫等活动中起着关键的作用[28]。结果表明,LSP156通过提高肝功能、调节氧化应激、降低脂质损伤以及抑制炎症反应来减轻NDEA造成的肝损伤,具有非常良好的保肝活性,但其具体的作用机制仍需进一步深入研究。