云南某奶牛场犊牛腹泻的病原学检测

陈 茜，岳 华，汤 承

（西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041）

犊牛腹泻是由病毒、细菌、寄生虫等病原微生物感染或管理不当等多种因素造成的［1-2］，其中病毒感染是引起犊牛腹泻的主要原因，牛A群轮状病毒（BRVA）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛冠状病毒（BCoV）是引起犊牛腹泻的常见病原［3-4］，牛诺如病毒（BNoV）、牛凸隆病毒（BToV）和牛纽布病毒（BNeV）等新发病原近年来也在我国陆续检出。细菌感染是导致犊牛腹泻的另一个常见因素，其中沙门氏菌（Salmonella）和产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是导致犊牛腹泻的重要病原菌［5］。安氏隐孢子虫（C.andersoni）作为牛场中常见的寄生虫，可单独感染致病，也可与细菌、病毒混合感染导致犊牛腹泻［6］。

1 材料与方法

1.1 腹泻样本来源 2020年12月云南某奶牛场送检了16份30日龄犊牛腹泻粪便样本，患畜临床表现为发热、精神沉郁、水样腹泻、严重脱水等。

1.2 主要试剂及仪器 TrizolTMReagent、Prime ScriptTM、2×Taq PCR Master Mix 等购于TaKaRa公司；DNA Marker II 购于宝生物工程（大连）股份有限公司；普通PCR 仪、核酸蛋白电泳仪和凝胶成像系统VersaDov2000购自Bio-Rad公司。

1.3 阳性核酸 9 种病原（BRVA、BCoV、BVDV、BNeV、BNoV、BToV、Salmonella、ETEC、C.andersoni）的阳性核酸均由西南民族大学动物医学实验室保存。

1.4 引物来源 参照文献［9-17］中的检测方法，对BRVA、BCoV、BVDV、BNeV、BNoV、BToV、Salmonella、ETEC、C.andersoni分别进行检测。引物由生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息见表1。

表1 RT-PCR引物信息

1.5 样本处理及核酸提取 将16份犊牛腹泻样本用磷酸盐缓冲溶液（pH＝7.4）处理后，分别进行DNA 和RNA 的提取。DNA 的提取采用酚-氯仿法。RNA 的提取步骤按照Trizol 试剂盒（RNAiso Plus）说明书进行，并使用Prime ScriptTMRT 试剂盒将RNA 反转录为cDNA，置于-20 ℃冰箱待用。

1.6 PCR 检测 用BRVA、BCoV、BVDV、BNeV、BNoV、BToV、ETEC、Salmonella、C.andersoni的引物对16 份犊牛腹泻粪便样本的cDNA 及DNA 模板进行PCR 检测，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统观察结果，将阳性PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司测序。将BRVA 阳性样本用VP4 蛋白、VP7 蛋白的分型引物进行PCR 检测，以确定BRVA 的P 基因型和G基因型。

2 结果

2.1 病原检测结果 在16 份犊牛腹泻样本中，BNeV、BRVA、BToV 和BNoV 的检出率分别为62.5%、37.5%、18.75%和6.25%，其余病原均未检出。其中BRVA与BNeV的混合感染率为31.25%，BToV 与BNeV 的混合感染率为6.25%，BRVA、BNeV、BNoV 的混合感染率为6.25%。PCR 检测电泳图见图1。

2.2 BRVA分型检测结果 6份BRVA阳性样本中，有2 个样本分别扩增出了VP7 基因目的条带（885 bp）与VP4 基因目的条带（1 094 bp），经RotaC 分型软件分析，结果显示为G8P［1］型BRVA。

图1 A为BNeV电泳检测结果；B为BRVA电泳检测结果；C为BToV电泳检测结果；D为BNoV电泳检测结果

3 结论与分析

图2 A和B分别为VP4和VP7分型电泳检测结果

本试验对该腹泻牛场的粪便样本进行了9种常见病原检测，结果表明BRVA、BNoV、BNeV 和BToV 这四种病原的混合感染是该场犊牛发生腹泻的重要原因，其中以BNeV和BRVA为主。

本研究对BNeV 的检出率为62.5%，表明BNeV是导致该地区犊牛腹泻的主要病原。本实验室前期研究已证明BNeV 在我国四川省、河南省、辽宁省、山东省和陕西省均有检出，有可能是导致以上地区犊牛腹泻的重要原因。目前尚无BNeV 的分离培养体系及有效疫苗预防，故应结合当地实际，健全饲养管理和消毒制度，对感染犊牛隔离后对症治疗。

本研究对BRVA 的检出率为37.5%，表明BRVA仍是导致犊牛腹泻的重要病原。疫苗接种是目前国外防控BRVA 最有效的措施，国内还没有商品化的BRVA 疫苗。需要注意的是，不同基因型BRVA 毒株的交叉保护力低，因此应加强对不同地区BRVA 的分子流行病学调查。本试验对该场阳性样本的分型结果显示为G8P［1］型BRVA。