LncRNA PITPNA-AS1靶向miR-491-3p基因调控宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制研究

陈静 叶晖 朱艳

宫颈癌是最常见的侵袭性妇科癌症之一，是全球女性癌症相关死亡的重要原因[1,2]。诊断和治疗技术的进步极大改善了宫颈癌患者的治疗。然而，由于宫颈癌的高度侵袭性和转移能力，晚期癌症患者的预后仍然很差[3]。此外，缺乏有效的筛选生物标志物和技术导致宫颈癌诊断不佳[4]。因此，了解宫颈癌的发生和转移的潜在机制，并开发出新的治疗策略来治疗该病至关重要。长链非编码RNA(long noncoding RNA，LncRNA)与许多疾病有关，尤其是肿瘤[4]。LncRNA PITPNA反义RNA 1(PITPNA antisense RNA 1，PITPNA-AS1)是新发现的LncRNA，位于染色体17p13.3，在宫颈癌中高表达，并通过靶向miR-876-5p/c-MET轴调节宫颈癌的细胞周期和凋亡[5]。但LncRNA PITPNA-AS1对宫颈癌细胞迁移和侵袭的作用尚不清楚。竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)理论的提出加快了人们对LncRNA的探索，LncRNA通过ceRNA调节微小RNA(MicroRNA，miRNA/miR)的表达[6]。miR-491-3p是已报道的肿瘤抑制因子，在视网膜母细胞瘤[7]、骨肉瘤[8]中低表达，并抑制视网膜母细胞瘤和骨肉瘤细胞生长和转移。本研究的生物信息学预测到LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p之间存在靶向结合位点，这表明LncRNA PITPNA-AS1可能通过miR-491-3p与宫颈癌进展相关。因此，本研究LncRNA PITPNA-AS1在宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭中的功能和机制进行考察，为宫颈癌新疗法的开发提供新的启示。

1 材料与方法

1.1 材料 宫颈癌细胞系(HeLa、SiHa、Caski)、宫颈上皮永生化细胞H8(上海雅吉生物公司)，siRNA阴性对照(si-NC)、siRNA LncRNA PITPNA-AS1(si-LncRNA PITPNA-AS1)、miR-491-3p mimics、miR-491-3p inhibitors(anti-miR-491-3p)、mimics/inhibitors阴性对照(miR-NC/anti-miR-NC)、pcDNA、pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1(广州RiboBio)，Revert AidTM Frist Strand cDNA试剂盒(加拿大Fermentas)，RIPA缓冲液、β-肌动蛋白(β-actin)一抗(美国Sigma-Aldrich)，BCA蛋白质测定试剂盒(美国Promega Corporation)，细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8；日本Dojindo公司)，Matrigel(美国EMD Millipore)，pmirGLO双荧光素酶报告载体、Dual-Glo荧光素酶测定试剂盒(美国Promega)。

1.2 细胞培养与分组 宫颈癌细胞HeLa、SiHa、Caski、宫颈上皮永生化细胞H8均维持在补充有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培养基中，并保持在37℃，5% CO2的湿润气氛中。将未处理的宫颈癌细胞HeLa设为对照(NC组)。根据Lipofectamine 2000试剂的说明，在宫颈癌细胞HeLa中转染si-NC(si-NC组)、si-LncRNA PITPNA-AS1(si-LncRNA PITPNA-AS1组)、miR-NC(miR-NC组)、miR-491-3p mimics(miR-491-3p组)、pcDNA(pcDNA组)、pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1(pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1组)、si-LncRNA PITPNA-AS1和anti-miR-NC(si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-NC组)、si-LncRNA PITPNA-AS1和anti-miR-491-3p(si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-491-3p组)。转染48 h后收获细胞。

1.3 qRT-PCR检测LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p表达 TRIzol试剂(每1×106细胞1 ml)用于提取细胞总RNA。溶解后，使用Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit结合特异性引物和逆转录酶将RNA(2.5 μl)逆转录成cDNA。随后使用Revert AidTM Frist Strand cDNA试剂盒扩增cDNA。记录每个样品的阈值(Ct值)，并使用2-ΔΔCt方法进行分析。将数据标准化为GAPDH(对于LncRNA)或U6(对于miRNA)。引物序列如下所示：LncRNA PITPNA-AS1：5’-GCAGGGTGGATAAAGAGGA-3’(正向)和5’-CCT

ACTGACAGGATGTCCT-3’(反向)；miR-491-3p：5’-’-ATGCAAGATTCCCTTCTACAAA-3’(正向)和5’-CAT

GATCAGCTGGGCCAAGA-3’(反向)；GAPDH：5’-GAA

GGTGAAGGTCGGAGT-3’(正向)和5’-GAAGATGGTG

ATGGGATTTC-3’(反向)；U6：5’-CTCGCTTCGGCAGC

ACA-3’(正向)，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(反向)。

1.4 Western Blot检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶(Matrix metalloprotease，MMP)-2、MMP-9蛋白表达 用RIPA缓冲液裂解每组宫颈癌细胞HeLa。使用BCA蛋白质测定试剂盒进行蛋白质定量。通过10% SDS-PAGE分离总共50 μg/泳道蛋白质，然后将其转移到聚偏二氟乙烯膜上。然后在室温下用脱脂乳在Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液(Tris buffered saline with Tween，TBST)中将膜封闭1 h。将膜与抗CyclinD1、MMP-2、MMP-9一抗和抗β-actin一抗(均为1∶1 000)在4℃下过夜。然后，将膜用TBST缓冲液洗涤，用辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体(1∶10 000)在室温保持2 h。使用Pierce ECL Western印迹底物可视化蛋白条带。蛋白质水平通过β-actin进行标准化，并使用ImageJ软件评估条带密度。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖 将宫颈癌细胞HeLa以2×103个细胞/孔的量接种在96孔板上，每组3孔。使用CCK-8在48 h时测量细胞增殖。向每个孔中总共加入10 μl CCK-8(5 mg/ml)。在37℃温育4 h后，在450 nm处测定吸光度A值。

1.6 Transwell法检测细胞迁移和侵袭 将宫颈癌细胞HeLa在无血清RPMI-1640培养基中，以5×104细胞/100 μl的密度接种到未涂(迁移测定)或预先涂有(侵袭测定)Matrigel胶(37℃放置2 h)的24孔Transwell板上层隔室中。下腔室装有500 μl RPMI-1640培养基，其中添加了10% FBS。在37℃下孵育24 h后，将穿过膜的细胞在室温下用75%甲醇固定15 min，然后在用0.1%结晶紫染色15 min。在Nikon光学显微镜下观察侵袭细胞。

1.7 双荧光素酶活性检测 用LncBase Predicted v.2软件预测LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p的结合区域。将含有miR-491-3p结合位点的LncRNA PITPNA-AS1-野生型(WT)片段插入pmirGLO双荧光素酶报告载体中以产生LncRNA PITPNA-AS1(WT)。将突变型(MUT)LncRNA PITPNA-AS1片段插入pmirGLO双荧光素酶报告载体，合成LncRNA PITPNA-AS1(MUT)。为了进行报告基因检测，将宫颈癌细胞HeLa接种到24孔板中，24 h后将上述报告质粒与miR-491-3p mimics或miR-NC一起使用Lipofectamin 2000共转染到宫颈癌细胞HeLa中。温育48 h后，收集转染的细胞，通过Dual-Glo荧光素酶测定试剂盒来测量相对荧光素酶活性。

2 结果

2.1 LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p在宫颈癌细胞系中的表达情况 宫颈癌细胞系HeLa、SiHa、Caski中LncRNA PITPNA-AS1表达水平均比宫颈上皮永生化细胞H8高，miR-491-3p表达水平均比宫颈上皮永生化细胞H8低，差异有统计学意义(P<0.05)。选择差异最显著的宫颈癌细胞HeLa进行后续研究。见表1。

表1 LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p在宫颈癌细胞系中的表达情况

2.2 LncRNA PITPNA-AS1低表达抑制宫颈癌细胞HeLa增殖、迁移和侵袭 在宫颈癌细胞HeLa中低表达LncRNA PITPNA-AS1，与NC组比较，si-NC组LncRNA PITPNA-AS1、CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平、细胞增殖、迁移和侵袭均差异无统计学意义(P>0.05)。而si-LncRNA PITPNA-AS1组LncRNA PITPNA-AS1、CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平比NC组低，细胞增殖、迁移和侵袭数量也低于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图1。

表2 LncRNA PITPNA-AS1低表达抑制宫颈癌细胞HeLa增殖、迁移和侵袭

图1 LncRNA PITPNA-AS1低表达抑制宫颈癌细胞HeLa迁移，侵袭以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平(结晶紫染色×100);A Transwell检测细胞迁移和侵袭;B Western Blot检测CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达

2.3 miR-491-3p抑制宫颈癌细胞HeLa增殖、迁移、侵袭 在宫颈癌细胞HeLa中过表达miR-491-3p，miR-491-3p组miR-491-3p表达水平比miR-NC组高，但CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平、细胞增殖、迁移和侵袭数量均比miR-NC组低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3，图2。

表3 miR-491-3p抑制宫颈癌细胞HeLa增殖、迁移、侵袭

图2 miR-491-3p抑制宫颈癌细胞HeLa迁移、侵袭以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白质表达水平;A Transwell检测下拨迁移和侵袭(结晶紫染色×100)；B Western Blot检测CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达

2.4 LncRNA PITPNA-AS1靶向miR-491-3p，调控miR-491-3p的表达 miR-491-3p和 LncRNA PITPNA-AS1靶向结合在LncBase Predicted v.2软件中预测。miR-491-3p组LncRNA PITPNA-AS1(WT)报告质粒共转染的HeLa细胞相对荧光素酶活性比miR-NC组低，差异有统计学意义(P<0.05)，miR-491-3p组与miR-NC组LncRNA PITPNA-AS1(MUT)报告质粒共转染的HeLa细胞相对荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。miR-491-3p表达水平在pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1组中低于pcDNA组，在si-LncRNA PITPNA-AS1组中却高于si-NC组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3，表4、5。

图3 LncBase Predicted v.2对miR-491-3p和 LncRNA PITPNA-AS1结合进行预测示意图

表4 miR-NC或miR-491-3p与报告质粒共转染HeLa细胞后双荧光素酶活性检测

表5 qRT-PCR检测miR-491-3p的表达

2.5 anti-miR-491-3p逆转LncRNA PITPNA-AS1低表达对宫颈癌细胞HeLa增殖、迁移、侵袭的抑制作用在宫颈癌细胞HeLa中同时低表达miR-491-3p和LncRNA PITPNA-AS1，si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-491-3p组miR-491-3p表达水平比si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-NC组低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平、细胞增殖、迁移和侵袭数量高于si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-NC组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表6，图4。

表6 anti-miR-491-3p逆转LncRNA PITPNA-AS1低表达对宫颈癌细胞HeLa增殖、迁移、侵袭的抑制作用

图4 anti-miR-491-3p逆转LncRNA PITPNA-AS1低表达对宫颈癌细胞HeLa迁移、侵袭以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平的抑制作用;

3 讨论

越来越多的研究表明，LncRNA的异常表达与各种人类癌症的进展密切相关。例如，lncRNA FTH1P3通过靶向miR-145在宫颈癌中起促癌因子的作用[9]。LncRNA PTENP1通过抑制miR-106b抑制宫颈癌进展[10]。资料显示，Sun等[11]在肝癌组织中观察到LncRNA PITPNA-AS1的升高，然后证明过表达LncRNA PITPNA-AS1通过miR-876-5p/WNT5A途径可以促进肝癌细胞的增殖和运动。LncRNA PITPNA-AS1在非小细胞肺癌组织和细胞系中高表达，LncRNA PIPTNA-AS1沉默通过靶向miR-32-5p抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移[12]。LncRNA PITPNA-AS1可通过miR-129-5p/HMGB1轴促进结直肠癌细胞的增殖和迁移[13]。尽管以前的研究表明，LncRNA PITPNA-AS1过表达对宫颈癌细胞的增殖具有促进作用[5]，但仍缺乏关于LncRNA PITPNA-AS1对宫颈癌转移作用的探索，因此需要进一步分析。这项研究与此前的数据一致，LncRNA PITPNA-AS1在宫颈癌细胞系中的表达明显上调。本研究首次表明，低表达LncRNA PITPNA-AS1可显著抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭。此外，低表达LncRNA PITPNA-AS1的宫颈癌细胞增殖和相关蛋白CyclinD1、MMP2、MMP9表达被抑制。总体而言，这些研究表明LncRNA PITPNA-AS1可能起癌基因的作用，并有利于宫颈癌的发生和发展。

LncRNA作为海绵发挥调节miRNA的作用[14]。本研究生物学预测后，发现LncRNA PITPNA-AS1与miR-491-3p之间存在紧密联系。miR-491-3p在宫颈癌细胞系中低表达，并与LncRNA PITPNA-AS1表达相反，暗示miR-491-3p可能由LncRNA PITPNA-AS1介导。这个假设已通过双荧光素酶活性检测得到了验证。在用si-LncRNA PITPNA-AS1处理的宫颈癌细胞HeLa中，miR-491-3p被促进，而pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1处理后，其表达被抑制，这表明LncRNA PITPNA-AS1可以充当miR-491-3p海绵，负向调控miR-491-3p。此前研究表明，miR-491-3p与多种癌症有关，例如肝癌、结肠癌[15,16]。miR-491-3p在胶质母细胞瘤中下调，miR-491-3p抑制胶质瘤细胞侵袭、增殖，并损害了胶质瘤干细胞的增殖。miR-491-3p在15对视网膜母细胞瘤组织和细胞系中显著下调。miR-491-3p的过度表达增强了视网膜母细胞瘤细胞凋亡，并显著抑制了视网膜母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。相反，miR-491-3p抑制剂导致相反的结果[7]。miR-491-3p在骨肉瘤组织和细胞系中的表达经常降低，其表达的恢复抑制了骨肉瘤细胞的生长和侵袭[8]。可见，miR-491-3p是肿瘤的抑制因子。本研究揭示了过表达miR-491-3p可以减弱宫颈癌细胞中的细胞增殖、迁移和侵袭，与前人研究相吻合[17]。此外，anti-miR-491-3p逆转了si-LncRNA PITPNA-AS1对宫颈癌细胞HeLa增殖、迁移、侵袭的抑制作用，表明LncRNA PITPNA-AS1通过靶向miR-491-3p发挥在宫颈癌中发挥作用。

总之，本研究表明，LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p参与宫颈癌细胞的细胞增殖、迁移和侵袭过程。LncRNA PITPNA-AS1加速宫颈癌细胞的生长和转移，机制与靶向miR-491-3p有关。这些结果可能为宫颈癌提供潜在的治疗目标和策略，以阻碍宫颈癌的进展。