饲料中添加凝结芽孢杆菌的评估

柳成东 ，吴有林 ，肖俊峰 ，肖丽萍 ，蔡 冬 ，梁世仁 ，丁能水 ，4

（1.福建傲农生物科技集团股份有限公司，福建 漳州 363000；2.福建省生猪营养与饲料重点实验室，福建 漳州 363000；3.福建傲农生物制药有限公司，福建 漳州 363000；4.江西农业大学猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室，江西 南昌330045）

近年来，随着禁止在饲料中添加促生长药物饲料添加剂的研究，对饲用益生菌的研究越来越受到饲料行业的关注。凝结芽孢杆菌作为唯一1 株具有芽孢体，能够分泌乳酸的饲用益生菌，成为当前的研究热点。已有研究表明，凝结芽孢杆菌能够调节畜禽肠道菌群，改善畜禽生长性能。与此同时，也有研究表明凝结芽孢杆菌与其他商业益生菌组合饲喂效果低于单一饲喂凝结芽孢杆菌的效果。因此，如何科学、合理地评估凝结芽孢杆菌在饲料添加剂中的运用效果，需要建立一套较为合理、有效体外评估体系。

一般而言，饲用益生菌在畜禽生产中的应用，往往面临饲料加工过程中高温，畜禽肠道酸性环境，及胃中胆盐的挑战。同时，抑菌性能作为益生菌发挥益生功能的重要指标，对抑制畜禽肠道有害菌，以及饲料源中的有害菌—金黄色葡萄球菌有重要的作用。此外，通过抑菌效果能够有效评估益生菌之间的颉颃作用，进而选择合理的有效组合方案。饲用益生菌应用于畜禽体内时，应该注意益生菌在发挥益生菌功能，更应该关注益生菌是否会对畜禽体内供氧和提供养料的红细胞造成损伤。据此，文章以凝结芽孢杆菌为研究对象，通过体外评估的方法，说明饲用益生菌能够作为饲料添加剂在畜禽养殖、饲料和饲料添加剂生产企业中的运用提供体外评估思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

凝结芽孢杆菌（YNAU 3127）选自云南当地品种“大河猪”肠道中分离、纯化的菌株，经溶血实验评估后，表明该株凝结芽孢杆菌具有可靠的安全性；在保证对畜禽本身无损伤的基础上评估其耐受性和抑菌性能。

指 示 菌： 大 肠 杆 菌K88（Escherichia coliCGMCC1.2385）、鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorumBNCC124693）； 金 黄 色葡萄球菌（Staphylococcus aureusBNCC186335）；枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus subtilisATCC PTA-6737）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformisbio-58806）、丁酸梭菌（Clostridium b u t y r i c u mB N C C 3 3 7 2 3 9）、屎肠球菌（Enterococcus faeciumbio-67122）、粪肠球菌（Enterococcus faecalisBNCC192631）、 酵 母 菌（Candida utiliBNCC336517）。以上菌株均购买自北纳创联生物科技有限公司和北京百欧博伟生物科技有限公司。

1.2 实验试剂

MRS 培养基（g/L）：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、牛肉膏5 g、葡萄糖5 g（无需分开灭菌）、氯化钠（NaCl）2.5 g、氯化钙（CaCl2）0.15 g、一水硫酸锰（MnSO4·H2O）0.1 g、番茄粉0.5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL。用于凝结芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌和酵母菌的培养，以及凝结芽孢杆菌对大肠杆菌K88、鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌混合抑菌的液体培养基；和凝结芽孢杆菌对丁酸梭菌、屎肠球菌、粪肠球菌、屎肠球菌和酵母菌的牛津杯法抑菌涂布培养基。

RCM 培养基（g/L）：酵母浸膏0.3 g、牛肉膏1 g、胰蛋白胨1 g、葡萄糖0.5 g、可溶性淀粉0.1 g、NaCl 0.5 g、三水合乙酸钠0.3 g、半胱氨酸盐酸盐0.05 g，用于丁酸梭菌的培养。

LB 培养基（g/L）：酵母膏5 g、胰蛋白胨10 g、Nacl 10 g、蒸馏水1 000 mL。用于大肠杆菌K88、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的培养。

血琼脂培养基：在MRS 培养基的基础上加入10%的无菌脱脂猪血。

分析试剂：猪胆盐、盐酸（HCl）、氢氧化钠（NaOH）。

1.3 溶血实验的评估实验步骤

β- 溶血实验设计如下：将大肠杆菌K88 具有溶血现象作为对照组，对比评估凝结芽孢杆菌（YNAU 3127）是否具有溶血现象。操作如下：将血琼脂培养基倒入无菌二分塑料培养皿（购买于海门博大实验器材厂），冷却、凝固后在培养皿左右两边各放置一个牛津杯，并同时各加入100 μL 的ETEC K88菌液和凝结芽孢杆菌菌液，并置于恒温培养箱中培养。培养24 h 后，通过观察是否出现溶血圈，验证该株凝结芽孢杆菌的安全性。

1.4 凝结芽孢杆菌耐受性实验步骤

1.4.1 凝结芽孢杆菌耐高温实验步骤

将凝结芽孢杆菌培养液按2%的接种量接种到MRS 培养基中；分别取5 mL 到规格为10 mL 的无菌EP 管 中，置 于70 ℃、80 ℃和90℃的水浴锅中处理10 min 后，采用平板计数法检测菌落个数。

1.4.2 凝结芽孢杆菌耐酸实验步骤

将配制MRS 液体培养基，分装到250 mL 的三角锥瓶中，每瓶分装100 mL；分装后用70% HCl和30% NaOH 对其培养基进行酸碱调定，分别将pH 调到1、2、3、4、5、6、7，调完后121℃灭菌30 min。将凝结芽孢杆菌培养液按2%的接种量接种到MRS 培养基中，置于气浴恒温振荡器（37℃、180 r/min）培养后，培养24 h，计数。

1.4.3 凝结芽孢杆菌耐胆盐实验步骤

分别称取一定量的胆盐加入到装 有100 mL 的MRS 培 养 液，配制 成 含0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%浓度的MRS 培养液后，121℃灭菌30 min；待冷却后，将凝结芽孢杆菌培养液按2%的接种量接种到MRS 培养液中，置于摇床（37℃、180 r/min）24 h 培养后，计数。

1.5 抑菌实验步骤

1.5.1 共培养抑菌法

分别接种200 μL 的凝结芽孢杆菌和200 μL 的大肠杆菌K88、鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌到200 mL 的MRS 培养基中，置于摇床（37℃、180 r/min）24 h 培养后，分别采用平板计数大肠杆菌K88、鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的菌落数。

1.5.2 牛津杯法抑菌法

采用经典的牛津杯法评估凝结芽孢杆菌对商业益生菌的抑菌效果。具体操作如下：将凝结芽孢杆菌和商业益生菌分别接种于发酵培养基中，置于摇床（37 ℃、180 r/min）24 h 培养后；取200 μL 稀释到10-2的商业益生菌的菌液均匀涂布到MRS 培养基上，涂干后，在培养基上放置一个牛津杯，加入100 μL的凝结芽孢杆菌菌液。然后，将培养皿放置37.5℃恒温培养箱中培养24 h， 之后测定抑菌圈直径（diameter of inhibition zone，DIZ）。每次操作，每个指示菌涂3 个培养皿（3 次平行测定），统计测定结果的平均值。

2 结果

2.1 凝结芽孢杆菌安全性评估实验结果

由图1 可见，在牛津杯中加入大肠杆菌K88 菌液的血琼脂培养基平板上，出现了明显的溶血圈（R）。在牛津杯中加入凝结芽孢杆菌的血琼脂培养基平板上，无溶血圈（L），判定该株凝结芽孢杆菌对细胞的无破坏作用。

图1 凝结芽孢杆菌溶血性实验评估（β-溶血实验）

2.2 凝结芽孢杆菌耐高温性实验结果

由表1 结果可知，该株凝结芽孢杆菌在70℃的高温下存活率高达90.5%，在高温90 ℃下，菌株存活率仍然高达51.2%，说明该株凝结芽孢杆菌在高温下存活良好。

表1 凝结芽孢杆菌耐高温的实验结果 %

2.3 凝结芽孢杆菌耐酸性实验结果

由表2 结果显示，该株凝结芽孢杆菌在pH=3 的酸性环境下，存活率能够达到14.25%。相反，当pH=6 的微酸性环境下，该株凝结芽孢杆菌存活率为155%。

表2 凝结芽孢杆菌耐酸性实验结果 %

2.4 凝结芽孢杆菌耐胆盐试验结果

根据表3 结果可知，随着胆盐浓度的升高，该芽孢杆菌的存活率略有下降。当胆盐浓度达到0.3%，凝结芽孢杆菌的存活率仍然在70.0%，表明该菌株对胆盐有很强的耐受性。

2.5 凝结芽孢杆菌对有害菌的抑菌实验结果

由表4 结果可知，凝结芽孢杆菌对鸡白痢沙门氏菌的抑制作用最强；同时，对大肠杆菌K88 和金黄色葡萄球菌也有较好的抑制作用。

表4 凝结芽孢杆菌对有害菌的抑菌性能的实验结果

2.6 凝结芽孢杆菌对商业益生菌的抑菌实验结果

由表5 结果可知，凝结芽孢杆菌对不同商业益生菌之间抑菌效果差异显著（P＜0.05）；其次，凝结芽孢杆菌对丁酸梭菌的抑制效果最佳。但对粪肠球菌和酵母菌无抑制效果。

表5 凝结芽孢杆菌对商业益生菌的抑菌的实验结果 mm

3 讨论

3.1 凝结芽孢杆菌溶血实验安全评估

β-溶血实验常用于体外评估菌株毒性及所产毒素对细胞及膜结构的破坏作用。因此，本研究运用β-溶血实验验证凝结芽孢杆菌是否对细胞的有破坏效果。图1 显示凝结芽孢杆菌对红细胞无破坏作用，表明凝结芽孢杆菌无毒性和不产细菌毒素，可安全应用于饲料添加剂和畜禽养殖生产中。

3.2 凝结芽孢杆菌耐受性的评估影响

益生菌的耐受性能是依据实际生产过程中高温制粒，畜禽肠道酸性环境和胆盐破坏而进行的评估的指标。由耐受结果可知，该株凝结芽孢杆菌具有良好的耐高温、耐酸和耐胆盐的性能（表1、表2 和表3），这一结果与前人报道一致。这也验证了饲用凝结芽孢杆菌在饲料生产环节中和畜禽肠道环境中能够降低损耗。

表3 凝结芽孢杆菌猪胆盐的耐受实验结果 %

3.3 凝结芽孢杆菌对有害菌的抑制作用

大肠杆菌K88、鸡白痢沙门氏菌是引起猪只和鸡腹泻的主要致病菌，导致生产性能下降。同时，金黄色葡萄球菌是饲料及饲料原料中主要污染菌，常常会导致动物肠道和肝脏受到毒素的破坏，导致生产性能下降和死亡率增加。本研究显示，凝结芽孢杆菌对大肠杆菌K88、鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌效果，这个结果与以往的报道基本一致。这说明，该株凝结芽孢杆菌能够在饲料和畜禽养殖生产中运用，提高畜禽生长性能和对饲料有一定的保护作用。

3.4 凝结芽孢杆菌对商业益生菌的抑制作用

饲用益生菌添加符合我国实际34 种饲料添加剂的使用规范（《饲料添加剂品种目录》，2020）。生产中常常以添加单一菌和组合菌的方式改善畜禽生长性能，满足我国在研发禁用促生长药物饲料添加剂的需求。本研究表明，该株凝结芽孢杆菌对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和屎肠球菌具有抑菌效果；但对粪肠球菌和酵母菌无抑制作用，这一结果与前人报道一致。本实验研究首次发现，凝结芽孢杆菌对益生菌丁酸梭菌也有一定的抑制作用。以上结果显示，凝结芽孢杆菌在与枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、屎肠球菌组合使用过程需谨慎考虑。

4 结论

本研究考虑饲用益生菌凝结芽孢杆菌在运用过程中，首先要满足菌株的安全性，进而对饲用凝结芽孢杆菌进行耐受性能测定，得出其符合饲用益生菌凝结芽孢杆菌在饲料工艺中和畜禽肠道中的运用依据；同时，验证凝结芽孢杆菌的抑菌性能。这样能够更好地提供凝结芽孢杆菌在饲料和畜禽养殖中，以及饲料添加剂中益生菌之间的组合运用研究依据。