毛细支气管炎患儿单核细胞TLR4、淋巴细胞CXCR3及血清Mig的表达及临床意义

付亚妮，汤勉

宝鸡市妇幼保健院儿童呼吸科1、儿童重症科2，陕西 宝鸡 721000

毛细支气管炎是高发于婴幼儿的一种下呼吸道感染疾病，多为病毒感染引起[1-2]。有研究表明，毛细支气管炎发展到严重阶段时可使患儿高频率喘息，进展为哮喘的概率大大增加[3]。免疫细胞、细胞因子和趋化因子等均参与了毛细支气管炎的发生发展。趋化因子是近年来临床研究的热点，其受体是G蛋白偶联7次跨膜受体的超家族，其与其受体特异性结合后可发挥相应功能。趋化因子CXCR3是CXC的受体之一，其主要在CD4+T、CD8+T、自然杀伤及树突等细胞表面存在，属Th1大类受体，介导一系列炎症反应[4-6]。CXCR3及其配体血清单核细胞趋化因子(Mig)参与了肿瘤、病毒感染性疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反应等的免疫反应，其在免疫调节方面的作用已被临床研究所证实[7]。众所周知，毛细支气管炎与哮喘有着密不可分的联系，前者发展到一定程度会诱发后者，CXCR3及其Mig与哮喘的发生发展相关[8]，那么其是否在毛细支气管炎中发挥相似的作用？目前报道较少。Toll样受体-4(TLR4)主要表达于单核、巨噬细胞表面，能够识别病原体，有研究称，毛细支气管炎患者外周血TLR4水平显著较正常者增加，提示TLR4参与了毛细支气管炎的发生过程中[9]。本研究检测毛细支气管炎患儿外周血淋巴细胞表面CXCR3的表达率及血清中其配体Mig的浓度水平，研究毛细支气管炎血单核细胞中TLR4表达与CXCR3及其CXCR3的配体Mig水平变化的相关性，探讨毛细支气管炎可能的发病机制，为临床诊断和治疗毛细支气管炎提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月至2020年5月在宝鸡市妇幼保健院治疗的110例毛细支气管炎患儿作为观察组，根据呼吸危重评定表(RDAI)评分[10]分为轻中度(RDAI≤8分)患儿65例，重度(RDAI≥9分)患儿45例。纳入标准：(1)年龄≤2岁；(2)均为初治患儿；(3)诊断符合《诸福棠实用儿科学》中的标准[11]；(4)患儿监护人知情同意。排除标准：(1)研究前1个月内有免疫制剂药物服用史；(2)合并有肝肾功能障碍、自身免疫系统疾病、遗传代谢性疾病等其他严重疾病。110例患儿中男性66例，女性44例；年龄3～15个月，平均(11.28±2.01)个月。同时选取在宝鸡市妇幼保健院体检的健康儿童50例作为对照组，其中男性31例，女性19例；年龄3～18个月，平均(10.88±1.891)个月。观察组和对照组受检者的一般资料比较差异均无统计学意义(P＜0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 观察指标与检测方法 采集所有受试者血样样本3 mL。全血样本用EDTA抗凝管收集，室温保存，用于TLR4、淋巴细胞CXCR3的检测。根据红细胞裂解液(Lysingbuffer，美国BD Pharm Lyse州公司)说明书裂解红细胞，按照美国BioLe-gend公司生产的单核细胞TLR4、淋巴细胞CXCR3检测试剂盒说明书孵育抗体，多聚甲醛固定，用流式细胞仪(FACS Calibur，美国BD公司)于48 h内完成检测。采用ELISA方法检测血清Mig水平，ELISA试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。绘制标准曲线：先用ST-360型酶标仪(上海科华实验系统有限公司)检测标准品在90 pg/mL、60 pg/mL、30 pg/mL、15 pg/mL、7.5 pg/mL、0 pg/mL浓度下的OD值，应用CurveExPert1.3软件作图，以浓度为X轴，OD值为Y轴拟合出标准曲线，计算出其回归方程式。将所测的样品的OD值代入方程式中，计算得出样品浓度，乘以稀释倍数，即得待测样品浓度。

1.3 统计学方法 应用SPSS22.0统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，TLR4、CXCR3和血清Mig的相关性采用Pearson相关分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受检者的TLR4、CXCR3及Mig水平比较 观察组患儿的TLR4、CXCR3和Mig表达水平明显高于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 两组受检者的TLR4、CXCR3及Mig水平比较(±s)

表1 两组受检者的TLR4、CXCR3及Mig水平比较(±s)

组别观察组对照组t值P值例数110 50 TLR4(ng/mL)24.40±4.11 1.20±0.32 39.792 0.001 CXCR3(ng/mL)15.50±3.22 12.01±1.82 7.154 0.001 Mig(pg/mL)108.28±31.18 65.50±19.22 8.951 0.001

2.2 观察组不同严重程度患儿的TLR4、CXCR3及Mig水平比较 观察组重度组患儿TLR4、CXCR3和Mig表达水平明显高于轻中度组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 观察组不同严重程度患儿的TLR4、CXCR3及Mig水平比较(±s)

表2 观察组不同严重程度患儿的TLR4、CXCR3及Mig水平比较(±s)

组别轻中度组重度组t值P值例数65 45 TLR4(ng/mL)23.02±5.58 26.49±6.01-3.107 0.002 CXCR3(ng/mL)14.41±3.10 17.07±5.03-3.429 0.001 Mig(pg/mL)98.89±29.83 121.84±32.20-3.840 0.001

2.3 单核细胞TLR4、淋巴细胞CXCR3及血清Mig的相关性 将TLR4、CXCR3及Mig进行Pearson相关性分析，结果显示：TLR4与Mig呈正相关(r=0.680，P＜0.05)，CXCR3与Mig呈正相关(r=0.395，P＜0.05)，TLR4与CXCR3呈正相关(r=0.396，P＜0.05)，见图1。

图1 相关分析图

3 讨论

毛细支气管炎发生的主要机制是免疫功能异常，与免疫功能相关的细胞有很多种，其中比较典型的是T淋巴细胞亚群紊乱，即表现为CD4/CD8比值升高[12]。有研究称，趋化因子及其受体可以激活炎症细胞，炎症细胞可迁移至气道中，引发气道炎症[13]。CXCR3与其配体作用后会参与T细胞的激活和迁移，CXCR3本身的表达情况也会受到影响。气道炎症及上皮细胞的损伤参与了哮喘的发生发展，目前认为，在哮喘的发病机制中，有CXCR3及其配体的参与。研究发现CXCR3具有减少气道炎症和改善气道反应性的作用，目前关于CXCR3及其受体在毛细支气管炎患儿中表达特征的研究较少。

本实验采用流式细胞术检测CXCR3及Mig的表达特点，结果显示：观察组CXCR3和Mig表达明显高于对照组；观察组重度患儿CXCR3和Mig表达明显高于轻中度患儿。提示CXCR3与其配体结合后可加快炎症细胞向气道募集和迁移的速度，炎症区域处又会募集到大量炎症细胞，加重组织损伤，炎症因素被认为是毛细支气管炎的主要发病因素[14]。炎症反应发生时，Th1细胞大量分泌IFN-γ，其进一步刺激巨噬细胞分泌Mig，Mig浓度显著增加，Mig水平还可反映Th1细胞的免疫状态，可对疾病的严重程度进行评估。以往的研究表明，RSV感染大鼠肺泡灌洗液中Mig的水平显著升高，Mig水平升高促进了RSV感染引起的炎症反应[15]。

在哮喘发病过程中有嗜酸性粒细胞的参与，而毛细支气管炎与支气管哮喘发病机制具有一定的同源性。有研究表明，Mig参与了嗜酸细胞活化导致嗜酸性粒细胞向肺内的趋化和聚集过程[15-16]。结合本研究结果，毛细支气管炎患儿的血清Mig的水平均高于对照组，Mig可能参与了上述过程，促进了毛细支气管炎的发生与发展。

本研究结果显示：观察组TLR4水平明显高于对照组；观察组重度患儿TLR4水平明显高于轻中度患儿。Toll样受体在固有免疫和获得性免疫中均扮演了重要角色，可利用其来识别相应的病原体。在一些病毒感染性疾病中均有T LR4的参与，其主要影响机体的免疫反应。研究称在气道炎症疾病中，TLR4水平的升高可加重炎症反应，加重组织损伤[17]。还可使T细胞大量募集到机体受到免疫攻击的区域，使此区域变成来了机体T细胞抵抗感染、免疫反应的场所，气道上皮细胞受损程度加大。TLR4水平与气道受损程度呈正相关，也与疾病程度呈正相关关系。

本研究经Pearson法分析结果显示，TLR4水平与Mig、CXCR3水平呈正相关，CXCR3水平与Mig水平呈正相关。Mig具有趋化性，其能与CXCR3特异性结合，使机体发生Ras和ERK级联反应。在此状态下，大量炎症细胞诸如趋化粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞都被大量募集到炎症部位。再加上在此区域上还有CD8+T细胞和CD4+T细胞等免疫细胞发挥抗感染作用，使此区域的炎症反应更加严重，因此，组织损伤也更加严重。体现在气道炎症疾病中，可能会导致哮喘及其他一些炎症疾病。而毛细支气管炎气道高反应性主要与炎症反应、T细胞浸润和嗜酸性粒细胞聚集激活有关。结合TLR4的变化特点，考虑是毛细支气管炎患儿T细胞亚群水平紊乱，抑制了机体的免疫功能，导致呼吸道反复感染，伴随着Mig及CXCR3表达水平的升高，每种因子异常上升都会通过炎症级联反应促进其他因子的异常表达，共同促进疾病进展。

Mig和CXCR3不仅有促进T细胞向周围炎症部位的迁移的作用，还能使淋巴器官中不同活化淋巴细胞之间的作用不断增强。Mig和CXCR3结合后产生一系列反应，能够对机体对病原体的反应性发生变化。Mig具有特定的趋化作用，还能增强炎症因子释放及T细胞增殖过程。此外，过敏因素也可能参与了CXCR3致毛细支气管炎的过程中，因为毛细支气管炎中有嗜酸性粒细胞参与的机制已被临床证实[18]。而嗜酸性粒细胞与过敏反应存在密切关联，所以猜测CXCR3是促进了嗜酸性粒细胞的趋化性来引起了过敏性炎症。此外，CXCR3也可能诱导肥大细胞脱颗粒，促进肥大细胞在过敏性炎症中向平滑肌的趋化性。结合本研究结果，推测CXCR3不仅参与毛细支气管炎的炎症反应和气道高反应性的形成，而且过敏因子的存在会影响其在毛细支气管炎中的表达，这可能导致TLR4的增加。TLR4作用于淋巴细胞上，又会使CXCR3和Mig的表达量增加，三者呈正相关，共同参与毛细支气管炎的发生发展。

已有研究发现了CXCR3和Mig水平在哮喘和变应性鼻炎中的变化特点[19-20]，但CXCR3和Mig在毛细支气管炎中是如何影响病程的原因尚未有临床研究报道。本研究采用对照试验探索单核细胞TLR4、淋巴细胞CXCR3和血清Mig在毛细支气管炎中的表达特点及其相互关系具有一定的临床参考价值。然而，本研究对炎症机制的研究并不全面，还需要进一步的试验。

综上所述，毛细支气管炎患儿单核细胞TLR4、淋巴细胞CXCR3及血清Mig表达明显升高，且均与患儿病情程度有关，三者间表达呈正相关关系。