甜瓜白粉病和蔓枯病抗性种质资源的筛选及其抗性来源分析

曹燕燕,刁倩楠,姚东伟,陆世钧,郏惠彪,张永平∗

(1 上海市农业科学院设施园艺研究所,上海市设施园艺技术重点实验室,上海 201403;2上海惠和种业有限公司,上海 201899)

甜瓜(Cucumis meloL.)为葫芦科甜瓜属一年生蔓性草本植物。 甜瓜果实不仅味美香甜,多汁爽口,而且富含多种糖分和维生素,具有很高的营养价值和药用价值,深受广大消费者喜爱,为世界十大水果之一[1]。 近年来,我国甜瓜产业规模趋于稳定,种植面积和产量常年稳居世界首位。

白粉病和蔓枯病是甜瓜生产中的主要真菌病害。 白粉病在甜瓜露地栽培和保护地栽培中广泛发生,该病菌不仅能够侵染植物的叶片、叶柄和茎蔓,还能侵染其花和果实。 甜瓜感染白粉病后产量下降,果实的成熟度和含糖量受到影响,甜瓜的品质和商品性严重降低[2]。 蔓枯病是在甜瓜整个生育期都可发生的一种土传病害,在苗期发病率较低,在植株生长的中后期发病严重,茎蔓和叶片是最主要的发病部位,病害严重时还可为害果实[3],其在大田的发病率可达20%—30%,在连作地及设施温室高达80%,严重时甚至会导致绝产[4]。

目前,引起葫芦科作物白粉病的常见病原菌是单囊壳属的单囊壳菌Podosphaera xanthii(P.xanthii)和白粉菌属的二孢白粉菌Golovinomyces cichoracearum(G.cichoracearum)[5],前者是引起我国甜瓜白粉病发生的主要病原菌[6]。 已发现的甜瓜白粉病抗性基因包括Pm-1、Pm-2、Pm-3、Pm-4、Pm-5、Pm-6、Pm-A、Pm-B、Pm-C1、Pm-C2、Pm-D、Pm-E、Pm-F、Pm-G、Pm-W、Pm-X以及Pm-H等,但目前很少有抗性基因被克隆出来[7]。 张海英等[8]研究发现,甜瓜自交系K7-1 白粉病的抗性受一对显性基因Pm-2F控制,开发的1个SSR 分子标记CMBR120-172与该抗性基因紧密连锁。 卢浩等[9]研究发现,分子标记Mu7191 与抗白粉病基因Pm-PMR6-1 共分离。 蔓枯病是由亚隔孢壳属的瓜类黑腐球壳菌所引起,但至今尚未确定致病菌生理小种的分化[10]。 目前已发现Gsb-1、Gsb-2、Gsb-3、Gsb-4、Gsb-5、Gsb-6 等多个蔓枯病抗性基因,但至今未被成功定位和克隆[11]。 而随着甜瓜基因组研究水平的不断深入,与甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-1、Gsb-4 和Gsb-6 等相关的分子标记不断被报道[12-15]。

目前,白粉病和蔓枯病主要通过喷施药剂进行化学防治,但长期单一使用某种化学药剂不仅易使病原菌产生耐药性,还会破坏生态环境,进而威胁人类健康[16]。 防治这两种病害最根本和最经济有效的方法就是选育优质抗病品种,开展现有种质资源的抗病性鉴定是甜瓜抗病育种的关键。 本研究一方面对甜瓜种质资源的白粉病和蔓枯病抗性进行鉴定,另一方面对筛选到的抗病材料进行抗性分子标记分析,以期为甜瓜白粉病和蔓枯病抗性遗传改良及其抗病杂交组合的配制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的40 份甜瓜种质资源由上海市农业科学院设施园艺研究所提供,具体见表1。 其中,来源为自主选育的甜瓜种质均为高世代纯合材料。 试验所用的白粉病菌和蔓枯病菌均采集自上海市农业科学院庄行试验基地,经实验室分离纯化获得。

1.2 甜瓜和病原菌培养

挑选饱满的甜瓜种子进行浸种催芽,出芽后播种于塑料营养钵中,置于光照培养箱中进行培养,设置昼夜温度为25 ℃∕20 ℃,光照周期为16 h 光照∕8 h 黑暗。

将保存的白粉病菌接种到易感甜瓜植株上进行大量繁殖用于后续白粉病菌接种试验。 从保存的蔓枯病菌株挑取纯性菌丝块接种于PDA 培养基上(土豆200 g,葡萄糖20 g,琼脂15 g,蒸馏水1 L),置于生化培养箱中,25—28 ℃条件下暗培养1 周后用于蔓枯病菌接种试验。

表1 供试甜瓜种质资源Table 1 Melon germplasm resources used in this study

1.3 病原菌接种

白粉病病菌接种参照Zhang 等[17]的方法,将从感病叶片上扫下的新鲜病菌配制成浓度为106个∕mL的孢子悬浮液,均匀喷洒在植株叶片上,放培养箱培养。 培养条件为16 h 光照∕8 h 黑暗,相对湿度85%—95%。 12 d 后参照张学军等[18]的方法进行白粉病病情统计。 病情分级标准如下:0 级,无病症;1 级,病斑面积占整叶面积的1∕3 以下,白粉模糊不清;2 级,病斑面积占整叶面积的1∕3—2∕3,白粉较为明显;3 级,病斑面积占整叶面积的2∕3 以上,白粉层较厚,连片;4 级,白粉层浓厚,叶面开始变黄,坏死面积占叶面积的2∕3 以下;5 级,叶片坏死面积占整叶面积的2∕3 以上。 其中,病害级别为0—2 的个体记录为抗病,病害级别为3—5 的个体记录为感病。

蔓枯病病菌接种采用离体叶片菌丝块接种方法,具体操作参照Wang 等[19]的方法并稍作改动:剪取甜瓜植株完全展开的第3 或第4 片真叶(保留适当长度叶柄),用无菌水冲洗干净并晾干后放置到铺有3层滤纸的培养皿中,用直径为0.5 cm 的灭菌打孔器切取培养好的菌丝块,接种于甜瓜叶片的中央,每个叶片接种1 个菌丝块,每个甜瓜材料至少接种3 个叶片。 将培养皿放在光照培养箱中培养,培养温度(25 ±1)℃,16 h 光照∕8 h 黑暗,相对湿度90%—95%;5 d 后,测量病斑扩展半径,取平均值。 叶片侵染病情分级标准参照任琴琴等[20]的方法,具体如下:1 级为高抗(HR),扩展半径<1.8 cm;2 级为抗(R),1.8 cm≤扩展半径<2.3 cm;3 级为中抗(MR),2.3 cm≤扩展半径<2.8 cm;4 级为感(S),2.8 cm≤扩展半径<3.3 cm;5 级为高感(HS),扩展半径≥3.3 cm。

1.4 分子标记鉴定

1.4.1 甜瓜基因组DNA 的提取

待植株长至3 叶1 心时,取1.0 g 甜瓜叶片于研钵中,加液氮研磨成粉末,利用植物基因组DNA 提取试剂盒(TSP101-50,北京擎科生物科技有限公司)提取甜瓜基因组DNA。

1.4.2 PCR 反应体系及扩增条件

反应体系为:ddH2O 7 μL,2 ×TSINGKE Master Mix (blue)(含DNA 聚合酶、dNTP 等)10 μL,上游引物和下游引物(10 μmol∕L)各1 μL,DNA 模板(100 ng∕μL)1 μL。 所用引物序列详见表2。

反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,50—55 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,35 个循环;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存;me4em37 引物的扩增程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,35 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,35 个循环;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。

表2 白粉病和蔓枯病抗性来源鉴定所用分子标记引物Table 2 Molecular marker primers used for identification of the genetic resistance origin of powdery mildew and gummy stem blight

1.4 数据分析

利用Excel 2010 和SPSS 20.0 软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 甜瓜白粉病苗期抗性鉴定

40 份甜瓜种质资源的苗期白粉病抗性鉴定结果表明,白粉病抗病材料有11 份,分别为12-1-3A、13-5B、152、162、18-6-1A、18-7-5A、1948-1-1、651、B-1-1-1、M09-13 以及Q-1,其中,材料152 的发病等级为0 级,为免疫材料;其余29 份种质均为感病材料(表3)。

表3 甜瓜种质资源白粉病抗性鉴定Table 3 Identification of powdery mildew resistance of the melon germplasm resources

2.2 甜瓜蔓枯病抗性鉴定

采用离体叶片接种方法对40 份甜瓜种质资源进行苗期蔓枯病抗性鉴定分析。 结果表明,供试材料中,表现抗病的材料有2 份,分别为162 和651;表现中抗的材料有6 份,分别为1948-1-1、41S-19、B-1-1-1、M09-9-1、M09-13 和Q-1;表现高感的材料有2 份,分别为159 和E-1-1-1;其余30 份材料表现为感病(表4)。

2.3 抗白粉病甜瓜材料的抗性来源分析

利用抗白粉病基因分子标记引物me4em37 对苗期人工接种鉴定筛选到的11 份白粉病抗性甜瓜材料进行抗性来源分析发现,12-1-3A、13-5B、152、162、18-6-1A、18-7-5A、1948-1-1、B-1-1-1 以及Q-1 中扩增出目的条带,表明这9 份材料可能含有与抗病甜瓜收集一号相同的白粉病抗性基因[21](图1A);通过利用抗白粉病基因分子标记引物CMBR120-172对上述11 份材料进行抗性来源分析发现,152、162、18-6-1A、18-7-5A、B-1-1-1 以及Q-1 可用该引物扩增出172 bp 的目的条带,表明这6 份抗性材料可能含白粉病抗性基因Pm-2F(图1B)。

表4 甜瓜种质资源蔓枯病抗性鉴定Table 4 Identification of gummy stem blight resistance of the melon germplasm resources

图1 甜瓜白粉病抗性材料抗性来源检测Fig.1 Detection of the genetic resistance origin of the powdery mildew resistant melon

2.4 抗蔓枯病甜瓜材料的抗性来源分析

利用抗蔓枯病基因分子标记引物对筛选到的蔓枯病抗性材料进行抗性来源分析发现,材料162 和651 可用Gsb-1 分子标记引物CMCT505 扩增出190 bp 的目的条带(图2A),材料41S-19 可用Gsb-4 分子标记引物CMAT170a 扩增出180 bp 的目的条带(图2B),说明这3 个材料可能分别含有相应的蔓枯病抗性基因。

图2 甜瓜蔓枯病抗性材料抗性来源检测Fig.2 Detection of the genetic resistance origin of the gummy stem blight resistant melon

3 讨论

种质资源评价是育种中最重要的基础工作。 近年来,随着我国甜瓜种植面积的逐步扩大,各甜瓜种植区白粉病和蔓枯病危害逐年加重,严重制约了甜瓜产业的发展。 尽管目前存在一些白粉病和蔓枯病抗性甜瓜材料,但筛选新的抗病种质资源对甜瓜抗性品种选育及抗病聚合育种仍十分必要。

人工接种鉴定是筛选抗蔓枯病资源的一种重要手段。 目前,国内对甜瓜蔓枯病的抗性鉴定一般采用苗期接种方法,但该方法易受温度、湿度等环境条件的影响[22-23]。 作为人工接种方法的一种,离体接种鉴定方法具有准确、快速、筛选量大、受外界环境条件影响较小等优点[24],已广泛应用于甜瓜、黄瓜、西瓜和菜瓜等园艺作物的蔓枯病、疫病和炭疽病等的抗性鉴定[20,24-25]。

本研究通过苗期接种鉴定筛选出11 份甜瓜白粉病抗性材料,其中,9 份材料可用me4em37 分子标记引物扩增出目的条带,表明其可能含有与甜瓜抗病资源收集一号相同的白粉病抗性基因[21];6 份材料可用CMBR120-172分子标记扩增出目的条带,表明这些材料可能含有白粉病抗性基因Pm-2F。 另外,有8 份材料利用Mu7191 分子标记可扩增出1 个条带(结果未显示),这与卢浩等[9]报道的利用该引物在抗病材料中扩增出3 个条带的结果不符。 因此,这8 份甜瓜种质材料是否含有抗白粉病基因Pm-PMR6-1 还需进一步分析。

利用蔓枯病抗性基因相关分子标记对筛选出的蔓枯病抗病材料进行抗性来源分析结果表明,162 和651 这2 份材料含有Gsb-1 抗性基因,41S-19 材料含有Gsb-4 抗性基因;未发现材料含Gsb-2、Gsb-3 和Gsb-6抗性基因(结果未显示)。 已有研究表明,利用分子标记辅助筛选抗病基因的可靠性主要取决于分子标记与基因的连锁距离,即连锁距离越近,选择的准确性越高[26-27]。 本研究中一部分白粉病抗性材料和蔓枯病抗性材料未检测到抗病基因,其原因可能是所选的分子标记与抗性材料所含的抗病基因的连锁距离较远或不连锁。 因此,为了能够完整地评价材料的抗病性,需要开发和解析更多与抗病基因紧密连锁的分子标记。

本研究表明,162、B-1-1-1、M09-13 以及Q-1 材料同时兼抗白粉病和蔓枯病,后续可重点利用这4 份材料与优质甜瓜种质配制杂交组合,并加大甜瓜抗病种质资源的收集和评价鉴定工作。 同时,对现有资源进行遗传改良,并综合利用其他生物技术手段和物理手段创制新的种质资源,以期为优质、多抗甜瓜新品种的选育奠定良好的基础。