腈吡螨酯在橙汁加工过程中的残留行为

韩科，王夜梅，周胡怿，梁道崴，赵其阳,3，焦必宁,3*

1(西南大学 中国农业科学院柑桔研究所，重庆，400712)2(农业农村部柑桔产品质量安全风险评估实验室，重庆，400712) 3(农业农村部柑桔及苗木质量监督检验测试中心，重庆，400712)

柑橘害螨具有极强的繁殖性和抗杀螨性，已对部分化学杀螨剂产生了抗性，柑橘产业中迫切需要新的杀螨剂以解决现有杀螨剂的抗性问题[1-2]。腈吡螨酯是日本日产化学工业株式会社研发的新型高活性吡唑类杀螨剂，具有防效好、对非靶标生物安全等优点，在柑橘产业中具有良好的应用前景[1,3]。但根据日本食品安全委员会的研究，摄入腈吡螨酯可能会对人体造成肝细胞肥大、肾脏褐色素沉积和视网膜萎缩等不良影响[4]，但我国尚未建立该药在食品中的最大残留限量(maximum residue limit，MRL)[5]。

柑橘类水果季节性较强，常通过加工延长保质期[6]。橙汁是世界上贸易量和消费量最大的柑橘加工产品[7]，全世界近80%的甜橙被用于生产橙汁或各种提取物[8]，生产橙汁产生的副产物也被应用于开发富含纤维的食品[9]或用作食品调味剂[10]，但部分加工工序可能会使产品中的农药残留水平升高，增加食品的膳食风险[11-13]。柑橘加工产品中的农药残留水平与农药性质和加工方法等因素有关[14]。LI等[11]研究了吡虫啉、咪鲜胺等5种农药在橙汁商业化加工过程中的残留消解规律，发现榨汁是降低柑橘中农药残留的有效手段，果汁中的农药残留量仅占鲜果中残留量的1.0%～4.5%，但是脂溶性农药在皮精油中发生了富集。康霞丽等[12]研究了阿维菌素在橙汁加工过程中的残留行为，发现阿维菌素的残留量在榨汁后显著降低，但在皮精油中的残留量达到了3.48 mg/kg，富集倍数可达30倍。LI等[13]用家用榨汁机对柑橘全果进行榨汁，发现腈吡螨酯的残留浓度会在果汁中升高。因此，关注农药残留在食品加工过程中的残留动态，有助于我们对农药进行更准确的膳食暴露评估[15]，但目前尚未见腈吡螨酯在橙汁商业化加工过程中残留行为的报道。

基于此，本研究模拟橙汁商业化加工过程进行加工试验，使用改进的QuEChERS法结合超高效液相色谱-串联质谱(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)定量分析柑橘及其制品中的腈吡螨酯残留，以明确腈吡螨酯在橙汁商业化加工过程中的残留行为，以期为腈吡螨酯在柑橘加工食品中的安全评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腈吡螨酯标准品(纯度97.39%),金谛泽浩科技(北京)有限公司；乙腈、甲醇(色谱纯)，美国Sigma-Aldrich公司；甲酸(分析纯)，成都市科龙化工试验场；无水硫酸镁、氯化钠(分析纯)，江苏强盛化工有限公司；乙二胺基-N-丙基(primary secondary amine，PSA)、十八烷基键合相硅胶(C18)，上海安谱科学仪器有限公司；多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotube，MWCNTs)(纯度98%，内径10～20 nm)，成都中科时代纳能科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290-6495 液相色谱串联质谱仪，美国Agilent公司；Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司；CL31/CL31R多用途离心机，美国Thermo Fisher公司；IKA VORTEX GENIUS 3涡旋混匀器，重庆市瑞利电子仪器设备有限公司；CK2000型高通量组织研磨仪，北京Thmorgan生物科技有限公司；有机相针式滤器(0.22 μm)，上海安谱科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 田间试验

田间试验按照NY/T 3095—2017《加工农产品中农药残留试验准则》进行，供试品种为普通甜橙，试验样地分别位于重庆和湖南。在柑橘成熟前使用电动喷雾器以最高推荐剂量的5倍(750 mg a.i./kg)均匀喷施30%(质量分数)腈吡螨酯悬浮剂1次，于15 d后(推荐安全间隔期)采收完好无损、无病虫害的果实，并立即进行橙汁加工。

1.3.2 加工过程

橙汁加工在国家柑桔工程技术研究中心进行，以保证与橙汁商业化加工过程所使用的技术保持一致，加工程序参照康霞丽等[12]的方法，每批次加工鲜果质量约为1 500 kg，每次加工前使用CIP自动清洗系统清洗设备管道，在不同加工工序下随机采集清洗前全果、清洗前果肉、清洗后全果、清洗后果肉、初榨果汁、精滤果汁、非浓缩还原(not from concentrate,NFC)汁、浓缩果汁、皮渣、油水混合物和皮精油共9种样品，每种样品平行取样3次，贮存在-20 ℃下待测。

1.3.3 检测方法

1.3.3.1 前处理方法

采用改进的QuEChERS 法进行样品制备。准确称取9种基质各5.00 g于50 mL离心管中(皮精油称取2.00 g 并加入5 mL去离子水)，加入10.00 mL乙腈，振荡提取4 min；加入2.00 g无水硫酸镁和0.50 g 氯化钠，振荡3 min后以10 000 r/min离心4 min；移取3.00 mL上清液于装有50 mg PSA+50 mg C18+10 mg MWCNTs的离心管中，涡旋30 s后以3 800 r/min离心3 min，移取上清液过0.22 μm滤膜，待测。

1.3.3.2 色谱条件

色谱柱为Agilent eclipse plus C18柱(2.1 mm×50 mm, 1.8 μm)；柱温40 ℃；进样量1 μL；流动相A：0.1%(体积分数)甲酸水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱程序：0～0.2 min，90% A；0.2～1.0 min，90%～10% A；1.0～4.5 min，10% A，后冲洗时间0.5 min。

1.3.3.3 质谱条件

离子源：AJS-ESI+；干燥气温度250 ℃；干燥气流速14 L/min；氮气压力30 psi；鞘气温度375 ℃；鞘气流速12 L/min；毛细管电压4 000 V；喷嘴电压 500 V；iFunnel高：200 V，低：100 V。采用多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式进行离子检测，定性转化为m/z394.2→310.3 (碰撞能量，35 V)，定量转化为m/z394.2→254.1 (碰撞能量，30 V)。

1.4 数据统计

使用加工因子(processing factor, PF)表示加工过程中农药残留量的变化，其计算式见公式(1)：

(1)

PF值<1，表明加工过程中农药残留水平降低，反之则表示残留水平升高[11]。

使用IBM SPSS Statistics 20和Microsoft Office Excel 2010进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 方法验证

分别使用9种空白基质提取液配置质量浓度分别为2.5、10、50、200、500、1 000 μg/L的腈吡螨酯标准溶液，以峰面积(y)和质量浓度(x)进行线性拟合，得到回归方程和相关系数(R2)。通过加标回收试验来检验方法的准确度和精密度，每种基质设置0.01、0.1、2 mg/kg 3个添加水平，每个添加水平重复5次，从而得到不同基质中腈吡螨酯的回收率和相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)，以3倍信噪比作为检出限(limit of detection，LOD)，以最低添加水平作为定量限(limit of quantitation，LOQ)。结果如表1所示，腈吡螨酯在2.5～1 000 μg/L质量浓度线性关系良好，R2>0.99。3个添加水平下柑橘及其制品中腈吡螨酯的平均回收率为77%～109%，RSD为0.99%～9.57%，LOD为0.005～0.093 μg/kg，LOQ均为10 μg/kg。方法的准确度和精密度满足NY/T 788—2018《农作物中农药残留试验准则》的要求，适用于不同柑橘加工产品中腈吡螨酯残留的检测。

表1 腈吡螨酯在柑橘及其加工产品中的检测方法验证Table 1 Validation of the method for the determination of cyenopyrafen in citrus and its processing products

2.2 腈吡螨酯在橙汁商业化加工过程中的残留行为

2.2.1 加工试验可行性分析

在试验开展前使用自来水清洗加工设备并采集清洗液进行检测，结果表明设备和自来水中不含腈吡螨酯残留；在加工当日随机检测3份未清洗果，结果如表2所示，两地原料果中腈吡螨酯的残留量均大于0.1 mg/kg，满足NY/T 3095—2017《加工农产品中农药残留试验准则》的要求(原料果中目标农药的残留量要大于10倍LOQ或0.1 mg/kg)。因此，可以确保试验的准确性和可接受性。

2.2.2 腈吡螨酯在清洗果中的残留

清洗是橙汁商业化加工的第1步，本试验使用自来水和鼓泡机清洗原料果5 min后获得清洗果。如表2所示，清洗分别去除了两地柑橘全果中9.3%和17.2%的腈吡螨酯残留，PF分别为0.907和0.828，而去皮分别使柑橘中的腈吡螨酯残留量降低了86.4%和75.9%，表明腈吡螨酯的主要残留部位为果皮，这与LI等[13]的研究结果一致。清水清洗可以不同程度地降低柑橘中的农药残留，对于正辛醇/水分配系数(Kow)较小的农药，如谷硫磷(Kow=2.96)、噻苯咪唑(Kow=2.47)等，清水清洗后残留去除率很高[16]；脂溶性农药和内吸性农药容易迁移到柑橘果皮的蜡质层或果肉中[17]，因此清洗仅能去除果皮表面的腈吡螨酯(Kow=5.60)残留，而对柑橘内部的农药残留影响有限。LI等[11]和康霞丽等[12]研究了橙汁加工过程对农药残留的影响，发现清洗可以去除柑橘果皮表面的农药残留，但很难去除果肉中的农药残留，其中氟啶胺(Kow=4.87)的去除率仅为16.6%，但多菌灵(Kow=1.51)的去除率可达85.4%。

表2 腈吡螨酯在柑橘及其加工产品中的残留量和PFTable 2 Residue levels and PF for orange products and by-products during commercial processing

除农药本身的性质外，清洗方法、清洗时间等也会影响清洗效果[14]。杨冲等[18]比较了臭氧水浸泡、自来水浸泡和自来水超声对草莓中乙唑螨酯等12种农药的去除效果，发现浸泡时间相同，臭氧水浸泡对草莓中的农药残留去除率最高，其次为自来水超声和自来水浸泡。杨霄鸿等[19]比较了奶粉浸泡、清水浸泡等6种方法对黄瓜和草莓中吡唑嘧菌酯和嘧菌酯的去除效果，发现使用奶粉溶液浸泡处理可以去除黄瓜和草莓中60%～69%的农药残留，而清水浸泡仅能去除黄瓜和草莓中22%～41%的农药残留。IM等[20]研究了不同清洗时间和不同清洗溶液对枣果中毒死蜱残留的去除效果，发现2%(体积分数)乙酸溶液能够去除枣果中87%～99%的毒死蜱残留，并且当清洗时间为60 min时去除率最高，而使用清水冲洗仅能去除约50%的毒死蜱残留。

腈吡螨酯脂溶性较强，在水中的溶解度很小(0.30 mg/L，20 ℃)[13]，因此用清水清洗残留去除率较低，在橙汁加工过程中可使用不同的清洗方式增加柑橘中腈吡螨酯残留的去除率。

2.2.3 腈吡螨酯在果汁中的农药残留

使用JBT全果榨汁机直接压榨清洗后全果可得到初榨果汁。如表2所示，在初榨果汁中腈吡螨酯的残留量分别为0.040和0.097 mg/kg，残留量分别降低了94.8%(PF=0.052)和93.6%(PF=0.064)，PF均小于0.1，榨汁过程显著降低了柑橘中的腈吡螨酯残留。根据IM等[20]的报道，内吸性农药的Kow值越大，柑橘榨汁后越不容易残留在果汁中。腈吡螨酯脂溶性较强，在柑橘皮渣和果汁分离过程中仍然大量残留在皮渣中，所以在初榨果汁中只有很低的残留量。YIGIT等[14]也发现，残留在苹果和番茄中的脂溶性农药在榨汁后残留量会显著降低。但可能由于水果的类型和加工工艺不同，农药的Kow值与葡萄汁和番茄汁中的农药残留率没有关联[20]。

初榨果汁经过螺旋榨汁机加工后，可得到精滤果汁。如表2所示，两地的精滤果汁中腈吡螨酯的残留量分别为0.029和0.091 mg/kg，仅占原料果中残留量的3.8% (PF=0.038)和6.0% (PF=0.060)，可能由于精滤过滤掉了附着在果汁颗粒物上的农药分子，因此精滤果汁中的农药残留量比初榨果汁中的农药残留量低。LI等[11]和康霞丽等[12]也发现吡虫啉、阿维菌素等农药的残留量会在精滤后少量降低。

精滤果汁真空脱气后经95 ℃杀菌45 s，然后迅速冷却至37 ℃左右可得到NFC果汁。由表2可知，NFC果汁中的腈吡螨酯残留量分别为0.067和0.112 mg/kg，分别是原料果中残留量的8.6% (PF=0.086)和11.2% (PF=0.112)。热处理可以有效控制加工产品中的有害微生物，同时也可能降低加工产品中的农药残留水平。JANKOWSKA等[21]研究了热处理对水果中24种农药残留的影响，发现多数农药在热处理后去除率超过50%。但可能受杀菌时水分少量散失以及腈吡螨酯热稳定高的影响，本试验NFC果汁中的农药残留量比初榨果汁和精滤果汁中的农药残留量高。

将离心后的精滤果汁在三效四体降膜蒸发器中浓缩，设置进料温度为107 ℃，出料温度为50～60 ℃，可得到固形物含量为65%的浓缩果汁。如表2所示，浓缩果汁中腈吡螨酯的残留质量分数分别为0.158和0.535 mg/kg，PF分别为0.205和0.350，浓缩果汁中的农药残留量仍然显著低于鲜果中的残留量，并且浓缩果汁食用前一般会加水稀释，因此腈吡螨酯的残留水平会进一步降低[11]。果汁浓缩过程中会散失大量水分，腈吡螨酯热稳定性较高，浓缩时不易挥发和降解，因此与其他3种果汁相比，腈吡螨酯的浓度在浓缩果汁中较高。

2.2.4 腈吡螨酯在皮渣和皮精油中的残留

柑橘全果在经过JBT全果榨汁机压榨后，在废料出口可收集到皮渣。如表2所示，皮渣中腈吡螨酯的残留量分别达到了1.185和1.680 mg/kg，PF均大于1(1.538和1.101)，可能由于腈吡螨酯主要残留部位为果皮，所以在皮渣中的浓度较高。

将榨汁过程中喷淋榨汁机收集的油水混合物泵入一级离心机中进行分离，可得到皮精油。如表2所示，两地的皮精油中腈吡螨酯的残留量显著高于其他加工产品中的残留量，残留量分别为11.841和19.005 mg/kg，是清洗前全果残留量的15.360和12.456倍。可能由于腈吡螨酯易溶解在油水混合物中，当进行油/水分离时，其便富集在皮精油中；也可能是皮精油中富含具有良好溶解性的d-苧烯，使农药易渗透进入果皮蜡质层，导致皮精油中腈吡螨酯的残留量升高[12]。LI等[11]和康霞丽等[12]的研究也发现，阿维菌素(Kow=4.4)和氯氰菊酯(Kow=6.6)等脂溶性农药在皮精油中易富集，但吡虫啉(Kow=0.57)和多菌灵(Kow=1.51)等水溶性农药的残留量却低于原料果中的残留量。因此在利用柑橘皮精油的过程中，需重视腈吡螨酯等脂溶性农药的残留风险。

2.2.5 腈吡螨酯在柑橘加工产品中的PF

如表2所示，腈吡螨酯在不同产地的橙汁加工产品中，PF存在一定差异，可能是两地气候条件和栽培模式不同，使得腈吡螨酯在柑橘果实中的分布不同导致[14]。此外，腈吡螨酯在不同橙汁加工产品中的PF不同。清洗果和4种果汁中腈吡螨酯的PF均小于1，表明腈吡螨酯在清洗和榨汁后残留量降低；腈吡螨酯在皮渣和皮精油中的PF>1，表明腈吡螨酯在皮渣和皮精油中残留量升高。2个试验点的初榨果汁中，PF均较小(0.052和0.097)，表明榨汁是降低腈吡螨酯残留的有效手段。

3 结论

本研究通过橙汁商业化加工，明确了腈吡螨酯在橙汁加工过程中的PF和残留行为。结果表明，4种果汁中腈吡螨酯的残留量均显著低于柑橘鲜果中的残留量，PF均小于1，证明榨汁是降低柑橘中腈吡螨酯残留的有效途径；在柑橘皮精油中，腈吡螨酯的残留量显著高于原料果中的残留量，富集倍数可达15倍，因此在综合利用皮精油的过程中应该注意腈吡螨酯的残留风险。本研究有助于对腈吡螨酯进行更准确的膳食暴露风险评估，推进腈吡螨酯在柑橘产业中的应用以及柑橘中腈吡螨酯MRL的制定。