绵柔型白酒对小鼠酒精性肝损伤的影响作用研究

戴 源，陈杉彬，姜 欣，李红娇，姚逸萍，张晓蒙，宋 涛，李一澍，赵文梅，王妍凌，王德良

（1.江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏 宿迁 223800；2.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100015；3.酒类品质与安全国际联合研究中心，北京 100015）

酒精饮用后直接作用于人体内的肝脏，少部分会通过血液进入脑部，因此在人体内的代谢主要依赖于肝脏[1]。目前普遍认为长期饮酒容易导致肝脏脂肪变性、纤维化乃至肝硬化等酒精性肝损伤病变，引起相关疾病的发生。但短时间内大量饮酒，比经常性大量酒精摄入更为常见[2-4]。目前酒精性肝病患者人数逐年上升，而有研究表明，较多的初期酒精性脂肪肝和酒精性肝硬化患者并没有酗酒的病史[5]。可见，酒精性肝损伤与是否长期摄入酒精并不是简单的线性关系，而更应该与饮用方式、饮用对象、饮用个体等进行相关的综合考量。目前普遍认为摄入酒精不仅会对肝脏造成损伤，而且会对大脑认知功能产生一定的影响[6]。急性过量的酒精摄入易引起酒精中毒，引起胃出血，诱发心脑血管等疾病。但是目前研究表明，急性酒精摄入对青年人的记忆功能相关脑区与未饮酒人群相比并没有较大的影响[7-8]。同时通过急性酒精摄入早期脑部灌注改变的动脉自旋标记进行相关分析，也未发现显著性差异[9]。表明短期摄入酒精并不会对脑部造成损伤。但是急性过量摄入酒精可能会对肝肾等组织造成损害。

过量酒精摄入导致的疾病损伤发生机制较为复杂，致病机理及原因不是十分清晰，可能受到多方面的影响。氧化应激可能是其中较为重要的影响因素，当体内抗氧化机制无法应对产生的大量自由基时，无法维持相应的平衡，过度氧化应激就会破坏细胞的完整性，对细胞造成氧化损伤。酒精会诱导氧化应激和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的产生，在增加氧化应激产物的同时减少机体内产生的抗氧化因子，同时释放相应的细胞因子，导致线粒体功能障碍，引发内质网应激和其他损伤。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白（Kelch like epichlorohydrin associated protein，Keap1）-核因子E2相关因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）复合物是细胞抗氧化信号调控通路的关键因子，细胞氧化的防御机制主要是激活Nrf2抗氧化反应元件信号通路，来达到增强细胞抗氧化能力，控制其蛋白质产物参与解毒和消除反应性氧化剂和亲电剂的基因表达[10-12]。Nrf2活性部分由胞浆蛋白Keap1控制，在正常生理条件下，Nrf2蛋白与Keap1同源二聚体在细胞质内形成复合物，然后招募E3泛素连接酶，后者介导Nrf2蛋白的泛素化降解，不促进下游抗氧化相关基因的表达，当受到外源氧化刺激后，会导致Nrf2和Keap1解偶联，Nrf2蛋白从Keap1二聚体上分离，泛素化降解减少，细胞质内富集的Nrf2蛋白进而转入细胞核内，激活下游靶基因的表达并发挥抗氧化应激的作用[13-17]。目前通发现较多能够通过改善抗氧化通路的相关物质均是通过作用于Keap1-Nrf2相关通路发挥作用。

过量的ROS存在于细胞内，能够诱发氧化应激，导致氧化损伤，进而产生更多损伤[18]。氧化应激和炎症反应是紧密结合，密切相关的。炎症是一个复杂的生物学过程，在各种因素的刺激下，多种转录因子被激活，这些转录因子的激活促进促炎蛋白基因的表达，产生多种促炎介质或细胞因子，影响多种通路相关蛋白的表达，包括诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，INOS）、环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等，引发一系列的炎症反应，造成细胞及组织的损伤[19-22]。

已有研究表明中国白酒与食用酒精有本质的区别，微量酒体成分的存在丰富了白酒的风味，改善了饮用感受[23-26]。研究证实，部分微量酒体成分或具有减少因过量酒精摄入对机体产生的损伤的作用[27]，即微量酒体成分在其有效浓度范围内能够减少酒精性疾病的发生。研究表明，绵柔型白酒中含有核苷类似物等多种活性成分[28]。基于此，本研究通过灌胃食用酒精构建急性肝损伤动物模型，研究绵柔型酒样中微量酒体成分在肝损伤动物模型中的作用，为白酒不等于食用酒精提供实验论据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

49～56日龄雄性C57BL/6J小鼠（体质量18～22 g）：由斯贝福生物技术有限公司提供；饲养温度为（23±2）℃，相对湿度为（50±5）%，光照时间12 h/d，自由饮食，5只/笼，合笼饲养，实验动物的相关处理均严格遵守实验动物福利伦理与保护相关规定，并随时接受实验动物伦理委员会的监督与检查。

52%vol绵柔型酒样1#、52%vol绵柔型酒样2#（非市售，通过气质联用等检测其黄酮类、核苷类、愈创木酚类、吡嗪类等生物活性成分含量不同）：由江苏洋河酒厂股份有限公司提供；一抗（Nrf2、keap1、COX-2、iNOS与NF-κB）：英国Proteintech公司；二抗（Anti-rabbit）：美国CST公司；谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C），高密度脂蛋白胆固醇（high density liptein cholesterol，HDL-C）试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

EclipseCi-L光学显微镜：日本Nikon公司；Mini-PROTEAN Tetra电泳槽：美国Bio-Rad公司；ChemiScope 6000 Exp化学发光成像系统：中国勤翔公司；7500 Fast/7500实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-fqPCR）系统：美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组与造模

实验小鼠适应性喂养7 d后，将30只小鼠随机分成3组（包括食用酒精组、绵柔型酒样1#处理组、绵柔型酒样2#处理组）。其中食用酒精组灌胃52%vol食用酒精，绵柔型酒样1#处理组和绵柔型酒样2#处理组分别灌胃等剂量的52%vol绵柔型白酒1#和52%vol绵柔型白酒2#，灌胃量为12.5mL/kg体质量，灌胃结束后，禁食不禁水，8 h后，眼球取血，颈椎脱臼处死小鼠，取肝脏组织和血液进行后续实验，其中将右半部肝脏组织通过10%中性多聚甲醛固定制备石蜡切片，肝脏组织病理学变化采用苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin，HE）染色后观察；其余肝脏于-80 ℃低温冰箱保存备用[29]。

1.3.2 小鼠肝脏组织病理学检查

肝脏组织用10%中性多聚甲醛固定24 h后转入体积分数70%的酒精溶液中脱水处理24 h，常规石蜡包埋后制作厚度约4 μm的切片，使用C8H10进行脱蜡处理，不同体积分数酒精梯度（95%、90%、80%、75%）脱水，苏木精染色，盐酸醇分化；0.5%伊红染色后常规梯度不同体积分数酒精（75%、80%、90%、95%），体积分数100%酒精I（10 min），体积分数100%酒精II（10 min）再次脱水；最后经二甲苯透明后中性树胶封片，在Nikon光学显微镜Eclipse Ci-L下选取不同的视野拍照并分析肝脏组织病理学变化。

1.3.3 小鼠肝功能的检测

灌胃8 h后，小鼠眼球取血，静置30 min，3 000 r/min离心10 min得到血清，并将其转移至-80 ℃低温冰箱进行低温保存。通过赖氏法检测血清转氨酶谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）水平，具体操作步骤严格按照试剂盒使用说明书进行。

1.3.4 小鼠血脂水平的检测

小鼠体内血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的水平均通过相应试剂盒进行测定。

1.3.5 RT-fqPCR扩增

按Invitrogen试剂盒提取肝组织总核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），并根据过氧化氢酶（fungal catalase，CAT）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、微管相关蛋白1A/1B-轻链3（microtubule-associated protein 1a/1b-light chain 3，LC3）、P62、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因信使核糖核酸（messenger ri bonucleic acid，mRNA）序列设计PCR引物，CAT引物：上游5'-GGAGGCGGGAACCCAATAG-3'、下游5'-GTGTGCCATCTCGTCAGTGAA-3'；GSH引物：上游5'-GGTTCGAGCCCAATTTTACA-3'、下游5'-GGTTCGAGCCCAATTTTACA-3'；SOD引物：上游5'-CGGTGAACCAGTTGTGTTGT-3'、下游5'-AGTCACATTGCCCAGGTCTC-3'；阳性内参采用GAPDH，引物为：上游5'-CTCAACTACATGGTCTACATGTTCCA-3'、下游5'-TCACACACCAGCAGGTTATCATC-3'。引物合成由上海生工生物技术公司完成。RTfqPCR体系严格按照Vazyme试剂盒说明书进行。

1.3.6 数据分析

用SPSS 23.0软件对数据进行多组间方差分析和T检验，所有实验数据均为3个平行试验的平均值，结果采用“平均值±标准差”表示；图表由Origin 2018绘制。

2 结果与分析

2.1 绵柔型白酒对小鼠肝组织病理形态学的影响

由图1（A）可知，食用酒精组小鼠的肝组织结构、肝细胞排列未见明显紊乱，主要观察到中央静脉、汇管区周围及肝实质内均可见多量的肝细胞轻度变性，胞质疏松淡染，未发生明显的炎性改变。由图1（B）可知，绵柔型酒样1#处理组小鼠的中央静脉、汇管区周围及肝实质内均可见中等量的肝细胞轻度变性，胞质疏松淡染，未见明显的炎性改变。由图1（C）可知，肝脏组织被膜由厚薄均匀的富含弹性纤维致密结缔组织构成，肝小叶分界明显，排列规则，肝小叶中央为中央静脉，周围是大致呈放射状排列的肝细胞和肝血窦，肝细胞圆润、饱满；肝板排列规则、整齐，肝窦无明显扩张或挤压；相邻肝小叶之间的门管区无明显异常；未见明显的炎性改变。本实验中食用酒精组小鼠的肝组织发现存在较多肝细胞轻度变性情况，而无明显的炎症改变，而在绵柔型酒样1#处理组和绵柔型酒样2#处理组小鼠的肝细胞轻度变性情况基本一致，但数量更趋向于减少，比实验预期结果更为明显。表明在急性饮酒情况下，酒样中的乙醇已经开始对肝细胞造成损伤，但不会对肝组织形态学造成明显改变，与其他长期饮酒实验对肝组织形态学造成影响的结果有一定差异，且绵柔型酒样1#和2#情况均优于食用酒精组，可能是其中的活性物质对食用酒精造成的肝损伤起到了一定的保护作用，能够减少酒精带来的肝损伤危害。

图1 食用酒精及绵柔型酒样对小鼠肝组织病理形态学的影响Fig.1 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on the pathological morphology of liver tissue in mice

2.2 绵柔型白酒对小鼠肝脏功能的影响

由图2可知，与食用酒精组相比较，绵柔型酒样1#处理组和绵柔型酒样2#处理组小鼠血清中的AST、ALT水平均有一定程度降低。在AST水平上，绵柔型酒样1#和绵柔型酒样2#分别是食用酒精组的81.9%、84.4%，但三者之间均无显著性差异（P＞0.05）。而在ALT水平上，绵柔型酒样1#和绵柔型酒样2#分别是食用酒精组的78%和80%，差异显著（P＜0.05）。且绵柔型酒样1#组在AST和ALT水平上均不同程度低于绵柔型酒样2#组，但两者之间无显著性差异（P＞0.05）。表明绵柔型酒样在一定程度上确实能够缓解食用酒精造成的肝损伤。

图2 食用酒精及绵柔型酒样对小鼠血清中谷草转氨酶（A）及谷丙转氨酶（B）活性的影响Fig.2 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on the activities of aspartate aminotransferase (A) and alanine aminotransferase (B) in serum of mice

2.3 绵柔型白酒对小鼠血脂水平的影响

由图3可知，与食用酒精组相比较，绵柔型酒样1#组和绵柔型酒样2#组小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平相较食用酒精组出现下降，而HDL-C水平上升；与食用酒精组相比较，绵柔型酒样1#组和绵柔型酒样2#组血清中TC水平分别降低了17%和13%；TG水平分别降低了10.4%和6.5%；LDL-C水平分别降低了7.3%和5.9%；HDL-C水平分别升高了4%和3%。除在TC水平外，其他肝脏相关指标表明，绵柔型酒样1#对肝损伤严重程度要轻于绵柔型酒样2#，食用酒精造成的肝损伤情况最为严重。

图3 食用酒精及绵柔型酒样对小鼠血清中总胆固醇（A）、甘油三酯（B）、低密度脂蛋白胆固醇（C）及高密度脂蛋白胆固醇（D）的影响Fig.3 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on total cholesterol (A),triglyceride (B),low density lipoprotein cholesterol (C)and high density lipoprotein cholesterol (D) in serum of mice

2.4 绵柔型白酒对小鼠氧化通路相关分子蛋白表达水平及抗氧化相关指标的影响

Nrf2是CNC转录因子家族成员中活力最强的转录调节因子，活性主要受到Keap1负性调节，在正常情况下，与Keap1相偶联，被锚定在胞浆中；当受到外界氧化刺激时，导致Nrf2发生磷酸化，与Keap1解偶联，转移入核，和其专性伴侣结合成异二聚体，识别并结合抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）产生功能，Nrf2蛋白为细胞质胞浆蛋白。由图4及图5可知，绵柔型酒样1#组小鼠肝脏中细胞Nrf2细胞质胞浆蛋白表达量最低，绵柔型酒样2#组次之，食用酒精中最高；细胞质胞浆Nrf2蛋白明显和Keap1解偶联进入细胞核中进行相关表达发挥功能。同时Keap1基本不变，在绵柔型酒样1#和绵柔型酒样2#中均持平于在食用酒精组中的Keap1蛋白表达量。其对相关蛋白灰度值进行半定量分析，其结果一致。

图4 食用酒精及绵柔型酒样处理对小鼠肝组织氧化通路的影响Fig.4 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on oxidative pathway of liver tissue in mice

图5 细胞质胞浆Nrf2、Keap1免疫印迹结果半定量分析Fig.5 Semi-quantitative analysis of immunoblotting results of cytoplasmic Nrf2 and Keap1

由图6及图7可知，与食用酒精组相比较，绵柔型酒样1#组和绵柔型酒样2#组在氧化相关指标CAT、GSH、SOD水平相较食用酒精组出现不同程度的升高，其中在CAT和GSH水平升高差异显著（P＜0.05），而在SOD水平升高差异不显著（P＞0.05）；绵柔型酒样1#和绵柔型酒样2#的CAT、GSH和SOD含量无明显差异（P＞0.05）。绵柔型酒样1#和绵柔型酒样2#均在MDA水平上低于食用酒精组，同时绵柔型酒样1#略低于绵柔型酒样2#，且均无显著性差异（P＞0.05）。在氧化相关通路CAT、GSH、SOD的mRNA表达水平上，绵柔型酒样1#和绵柔型酒样2#不同程度的高于食用酒精组，均出现显著性差异（P＜0.05）；同时绵柔型酒样1#和绵柔型酒样2#两组间无显著性差异（P＞0.05），在SOD的mRNA水平上，绵柔型酒样1#组要略高于绵柔型酒样2#；综合来看，酒精能够造成肝损伤的部分原因可能是通过影响氧化应激信号通路的响应机制，使肝细胞内氧化应激调控失衡，造成损伤的结果。

图6 食用酒精及绵柔型酒样对小鼠过氧化氢酶（A）、超氧化物歧化酶（B）及还原型谷胱甘肽（C）和丙二醛（D）含量的影响Fig.6 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on contents of catalase (A),superoxide dismutase (B),reduced glutathione (C)and malondialdehyde (D) in mice

图7 食用酒精及绵柔型酒样处理组小鼠过氧化氢酶mRNA（A）、还原型谷胱甘肽mRNA（B）及超氧化物歧化酶mRNA（C）相对表达量Fig.7 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on relative expression of catalase mRNA (A),reduced glutathione mRNA (B)and superoxide dismutase mRNA (C) in mice

其中Keap1-Nrf2是一条重要的氧化通路，能够控制下游相关抗氧化元件、蛋白和相关酶活力来维持氧化平衡，进而应对氧化应激，提高抗氧化能力。在正常条件下，Nrf2与Keap1相偶连形成复合物，被锚定在细胞质胞浆中，不发挥相关的功能；当受到外界氧化刺激时，Nrf2减少了泛素化降解，更多的被磷酸化修饰，与Keap1解偶连，转移入核，发生相关作用，促进下游相关抗氧化物质的产生[30-31]。在食用酒精组中，明显可以观察到有较多的Nrf2进行相关的表达，而在绵柔型酒样1#组小鼠肝脏中细胞Nrf2胞浆蛋白表达量最低，绵柔型酒样2#组次之；同时在食用酒精组中，Keap1含量也略低于绵柔型酒样组中。表明细胞胞浆中Nrf2蛋白更多的参与磷酸化修饰，与Keap1解偶联，进入细胞核发挥功能。食用酒精组中的氧化相关指标CAT、GSH、SOD水平均比绵柔型酒样中不同程度的降低，MDA水平升高。同时食用酒精组在氧化相关通路CAT、GSH、SOD的mRNA表达水平上也相应的低于绵柔型酒样组。综合来看，酒精能够通过调控Nrf2是否磷酸化和Keap1相解离进而入核发挥功能，提高相应的抗氧化相关指标的含量及活力，来达到提高抗氧化的目的，缓解酒精造成的氧化应激的压力。同时，绵柔型酒样相较于食用酒精来说，更能够刺激Nrf2蛋白进入细胞核进行相关表达。

2.5 不同酒样对小鼠肝损伤炎症通路相关分子蛋白表达水平的影响

除了因为氧化应激对肝脏造成损伤，炎症也是危害之一。诱导型一氧化氮合酶（INOS）在炎症诱导下生成NO，是体内重要的生物活性分子和信号分子[32]；环氧化酶-2（COX-2）是一种在正常组织中较少表达的诱导酶，可以快速应答一系列促炎介质和细胞因子[33-35]。由图8及图9可知，与食用酒精组相比，绵柔型酒样1#处理组和绵柔型酒样2#处理组的炎症通路相关蛋白INOS、COX-2、NF-κB的蛋白表达量均不同程度的降低，其中INOS下降趋势更为明显，而COX-2和NF-κB的蛋白表达无显著变化；通过对相关蛋白印迹进行半定量发现，绵柔型酒样1#处理组和绵柔型酒样2#处理组炎症相关蛋白均不同程度降低，均在食用酒精组中表达最高。相对于食用酒精组，在INOS蛋白表达方面，绵柔型酒样1#和绵柔型酒样2#分别下降了13%和7%；在COX-2和NF-κB蛋白表达方面，分别降低了3.6%、3.7%，3%、4%，但均无显著性差异（P＞0.05）。表明通过急性饮酒后，对于体内炎症相关通路而言，食用酒精、绵柔型酒样1#和绵柔型酒样2#均能造成负面影响，但造成的程度不同，其中食用酒精程度较高、绵柔型酒样2#次之。

图8 食用酒精及绵柔型酒样处理对小鼠肝组织炎症通路的影响Fig.8 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on inflammatory pathway of liver tissue in mice

图9 炎症相关通路INOS、COX-2和NF-κB免疫印迹结果半定量分析Fig.9 Semi-quantitative analysis of western blot results of inflammation related pathways INOS,COX-2 and NF-κB

3 结论

为评价急性期内绵柔型酒中微量酒体成分的存在是否与食用酒精存在异同及相关微量成分的生理作用，采用两种绵柔型白酒和食用酒精灌胃小鼠，观察对小鼠急性酒精性肝损伤的影响作用。食用酒精组小鼠与绵柔型酒样1#组和绵柔型酒样2#小鼠相比较，健康程度及存活率基本无变化，通过病理切片显示，不论是食用酒精组小鼠还是绵柔型酒样组小鼠，均未对肝组织造成明显损害影响，均未发生炎性改变；但绵柔型酒样小鼠肝细胞轻度变性数量及情况均要优于食用酒精组小鼠。同时对不同组小鼠肝脏健康相关指标进行比较，结果表明，在食用酒精组中，血清AST、ALT、TC、TG、LDL-C水平均要高于绵柔型酒样组，同时HDL-C水平明显低于绵柔型酒样组。所有肝脏相关指标均能够表明，绵柔型酒样1#对肝损伤严重程度要轻于绵柔型酒样2#，食用酒精造成的肝损伤情况最为严重。同时绵柔型酒样相较于食用酒精确实能够在一定程度上减少酒精性肝损伤的产生。

目前研究结果表明，绵柔型酒样相较于食用酒精，虽然急性酒精摄入后时间较短，但仍能初步通过影响氧化通路的相关分子表达和炎症通路相关蛋白的表达，减缓酒精带来的损害，达到减少氧化应激对肝脏造成损害的目的。表明在有效浓度范围内，酒体中天然存在的微量功能成分具有减少酒精性损伤的作用。该结果提示在饮料酒生产过程中，通过调控微生态、改进生产工艺等途径，不断提高酒体中微量成分的含量，或是开发健康饮料酒的有效策略。