超高效液相色谱-串联质谱法测定淡水鱼中地西泮含量的不确定度评定

刘正富 敖云胜 孙东红 马之攀

（重庆市计量质量检测研究院，重庆 409000）

地西泮为镇静剂类药物，是一种安眠药，具有镇静、催眠、抗癫痫、抗惊厥等作用，用于治疗焦虑症、失眠、肌肉痉挛等疾病[1-2]。近几年在水产品中检出地西泮残留的事件时有发生。一些不法商家为了保证水产品新鲜，在运输过程中非法使用地西泮，用来降低水产品的新陈代谢，提高存活率，导致地西泮在水产品体内残留[3-4]。食用含有地西泮的水产品，会危害人体健康，引起嗜睡疲乏、动作失调、昏迷等症状，还可能使人体产生耐药性。若以含有地西泮的水产品作为加工原料，将对水产品加工、水产品罐头制造等轻工领域的产品质量和安全产生影响。GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》规定，地西泮在动物性食品中不得检出。目前地西泮的检测方法有液相色谱法[5]、气相色谱-串联质谱法[6]、液相色谱-串联质谱法[7]等，但是缺少对地西泮含量的不确定度评定的方法。本文建立超高效液相色谱-串联质谱法测定淡水鱼中地西泮含量的不确定度的评定方法，确定测量过程中不确定度的来源[8-9],分析并计算出超高效液相色谱-串联质谱法测定淡水鱼中地西泮含量的不确定度。

1 材料与方法

1.1 试剂、材料

甲醇、乙腈、氨水（色谱纯）；QuECHERS（100 mg PSA、40 mg C18、600 mg 无水MgSO4，25 mL）；超纯水（由ELGA 超纯水系统提供）；淡水鱼（市售，含有地西泮的试样）；地西泮标准溶液（浓度为1.000 mg/mL，相对扩展不确定度为1%（k=2），由阿尔塔公司提供）。

1.2 仪器

超高效液相色谱-串联质谱仪（Waters Xevo TQ-S 三重四级杆质谱仪，配有电喷雾离子源，美国沃特世公司）；电子天平（XPE 204，瑞士梅特勒-托利多公司）；高速冷冻离心机（Allegra 64R，贝克曼库尔特公司）；涡旋仪（IKA MS3 Digital，艾卡公司）。

1.3 样品前处理

称取样品2 g→加乙酸铵缓冲溶液8 mL，涡旋，静置→加1%氨水-乙腈溶液15 mL，5.0 g 无水硫酸钠提取→取上清液层溶液→剩余混合物中加入1%氨水-乙腈溶液15 mL 再次提取→取上清液层溶液，合并两次提取有机相→QuECHERS 净化→浓缩至近干→2.0 mL 的10%乙腈-水溶液溶解残渣→过滤。

1.4 标准溶液制备

移取0.5 mL 地西泮标准溶液（1.000 mg/mL）于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到地西泮中间液（10 μg/mL）。移取0.5 mL 地西泮中间液于50 mL 容量瓶中，用甲醇定容，得到地西泮标液（100 ng/mL）。分别移取地西泮标液50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、1 000 μL、2 000 μL 于6 个10 mL容量瓶，用空白基质溶液定容，得到浓度为0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL 的标准系列工作溶液。

1.5 仪器条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm 2.1×50 mm；柱温：40.0℃；进样量：1 μL；流速：0.2 mL•min-1；流动相：乙腈、0.1%甲酸水。离子源：ESI+；离子对：定量285.2 ＞193，定性285.2 ＞154；锥孔电压：90 V；碰撞能量：20 V。

2 数学模型

根据液相色谱-串联质谱法测定淡水鱼中地西泮含量的原理，依据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》、CNAS-GL006:2019《化学分析中不确定度的评估指南》建立不确定度评定的数学模型，淡水鱼中地西泮含量的计算公式为：

式（1）中：X为试样中地西泮的含量，单位μg/kg；C为样品溶液中地西泮的浓度，单位ng/mL；V为样品溶液的体积，单位mL；m为试样的质量，单位g；R为回收率。

3 结果与分析

3.1 不确定度的来源

从测量过程的试验步骤和数学模型分析，采用液相色谱-串联质谱法测定淡水鱼中地西泮含量的不确定度来源如图1所示。

图1 不确定度的来源

3.2 测量重复性引入的不确定度

按照1.3 小节的方法测量试样，测量数据及结果如表1 所示。

表1 重复性试验

根据JJF 1059.1-2012 的评定方法，计算出淡水鱼中地西泮含量的标准偏差为：

试样重复测量引入的不确定度为：

3.3 试样称重引入的不确定度

使用XPE204 电子天平称取试样，其检定证书给出的允差为±0.000 2 g，按均匀分布实际称取试样质量的平均值为2.023 7 g，则试样称重引入的不确定度为：

3.4 试样定容体积引入的不确定度

试样定容采用2 mL A 级单标线吸取管，根据JJG 196-2006《常用玻璃量器》，2 mL A 级单标线吸取管的容量允差为±0.010 mL，按均匀分布则吸取管引入的不确定度为：

在20℃时，乙腈的体积膨胀系数为1.37×10-3℃-1，水的体积膨胀系数为2.08×10-4℃-1，则10%乙腈-水溶液的体积膨胀系数为3.24×10-4℃-1。实验室环境温度控制在（20±2）℃，按均匀分布则温度引入的相对标准不确定度为：

因此，试样定容体积引入的不确定度为：

3.5 样品浓度引入的不确定度

3.5.1 标准物质含量引入的不确定度

由阿尔塔公司提供的地西泮标准溶液（浓度为1.000 mg/mL），相对扩展不确定度为1%（k=2），则标准物质含量引入的不确定度为：

3.5.2 标准溶液制备引入的不确定度

标准溶液制备过程中，实验室环境温度为（20±2）℃，根据JJG 196-2006《常用玻璃量器》、JJG 646-2006《移液器》、CNAS-GL006:2019《化学分析中不确定度的评估指南》，按均匀分布，标准溶液稀释过程中所使用的体积因容量瓶与移液枪容量允差、温度变化引入相对标准不确定度分量如表2 所示。

表2 标准溶液稀释过程引入的不确定度

标准溶液制备过程中，体积因容量允差引入的不确定度为：

标准溶液制备过程中，体积因温度变化引入相对标准不确定度为：

因此，标准溶液制备引入的不确定度为：

3.5.3 线性拟合引入的不确定度

测量标准系列工作溶液，6 个点通过最小二乘法拟合得到线性方程Y=5 106X+580，相关系数R2=0.999 8。标准工作溶液线性拟合数据如表3 所示。线性拟合引入的不确定度为：

表3 标准工作溶液线性拟合

3.5.4 仪器测量引入的不确定度

使用超高效液相色谱-串联质谱仪测定淡水鱼中地西泮含量，仪器根据JJF 1317-2011《液相色谱-质谱联用仪校准规范》进行校准，查询校准证书，给出的相对标准不确定度为3.6%（k=2），则仪器测量引入的不确定度为：

3.6 加标回收引入的不确定度

在试样中加入地西泮，按照1.3 小节的方法进行测量，回收率为94.0%、95.2%、93.5%、94.3%、92.1%、96.7%，平均值为94.3%，标准偏差为1.56%。加标回收引入的不确定度为：

式（14）中：z为加标回收试验的次数；为平均回收率；S(R)为标准偏差。

当置信度p=95%，自由度ν=n-1=5 时，查询JJF 1059.1-2012 的t值分布表可得，t0.05,5=2.57。根据CNASGL006:2019，用t检验来评价平均回收率与1.0 是否有显著性差异。

由于计算出来的t＞t0.05,5，说明平均回收率与1.0 有显著性差异，淡水鱼中地西泮的检测结果需要进行回收率校正，因此需要计算加标回收引入的不确定度。

3.7 合成标准不确定度

综合以上结果，测定淡水鱼中地西泮含量的不确定度分量如表4 所示。对表4 中的不确定度分量进行合成，得到合成相对标准不确定度：

表4 不确定度分量结果

3.8 扩展不确定度

当淡水鱼中地西泮含量为7.58 μg/kg 时，取置信水平为95%，k=2，淡水鱼中地西泮的扩展不确定度为：

淡水鱼中地西泮含量结果可表示为：X=(7.58±0.53)μg/kg，k=2。

4 结论

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定淡水鱼中地西泮含量的不确定度评定方法，通过对不确定度分量进行分析，结果表明，天平称取试样重量对不确定度的影响很小，仪器测量、标准溶液制备对不确定度的影响较大。在今后的检测工作中，确保仪器性能稳定、关注标准溶液制备，从而确保检测结果准确可靠。