生物活性玻璃-二氧化锰复合支架的制备与表征

施吉翔,翟 东,朱 敏,朱钰方

(1.上海理工大学 材料科学与工程学院,上海 200093;2.中国科学院 上海硅酸盐研究所,上海 200050)

尽管骨组织工程支架在过去几十年已取得了巨大的进步,但是很多支架材料仍无法满足临床要求。一方面,骨修复支架在植入缺损处后出现的炎症与氧化应激有关,而过氧化氢(H2O2)浓度过高是引起氧化应激的主要原因之一。另一方面,骨缺损处因供血不足而导致的供氧不足,严重影响了细胞生理活动、新血管形成和组织的生长[1-3]。而充足的氧气对改善细胞黏附、生长和分化至关重要[3]。在缺氧条件下,细胞会将葡萄糖转化为乳酸,导致细胞凋亡[4]。目前,无机过氧化物因能与水(H2O)反应生成氧气(O2)而作为释氧生物材料被用于氧气输送的研究,如过氧化钙、过碳酸钠和过氧化镁等[1]。Touri 等[5]在双相磷酸钙支架外包覆不同浓度的过氧化钙涂层,研究发现3%过氧化钙涂层支架在低氧条件下能提高骨细胞的生存和增殖能力。Lü 等[6]通过实验证明了混合20%过氧化钙的角蛋白/丝素蛋白支架能够在体外两周内稳定释放高水平氧,同时还具有抗菌功能。然而,过氧化钙在与水反应生成氧气的同时还产生了有毒的羟基自由基(·OH)而引起氧化应激[7]。因此,有必要寻找既有H2O2清除能力又有释放氧气功能且无毒副作用的生物材料用于骨修复材料复合。

通常,H2O2浓度过高是导致病灶部位炎症的主要因素之一。二氧化锰(MnO2)是一种优良的催化剂,可以催化分解H2O2产生氧气。将MnO2引入炎症部位可以清除过量H2O2并产生O2,有效改善炎症环境。目前已有研究表明,含有MnO2的纳米颗粒在癌症治疗、骨关节炎症、动脉粥样硬化等疾病的治疗方面展现出较大潜力[8-11]。因此,将MnO2引入骨修复支架,不仅可以通过催化分解骨缺损处过量H2O2而改善炎症状况,而且产生的氧气可以缓解骨缺损处供氧不足,从而提高细胞活力并促进骨修复。

生物活性玻璃(BG)具有良好的生物活性、优异的生物相容性、可降解性等特点[12-13]。与生物惰性材料不同,BG 植入物能与生物组织发生反应,在材料表面形成生物活性羟基磷灰石层,使骨骼组织与植入物间形成牢固的结合界面[14-15]。3D 打印技术具有精确控制结构的优势,近年来在骨组织工程支架制备领域得到广泛应用[16-17]。尤其是直接墨水书写打印,作为一种成熟的3D 打印技术,具有加工灵活、效率高、成本低、环境友好等优点[18-19]。Wu等[20]将介孔生物活性玻璃(MBG)和黏结剂聚乙烯醇(PVA)通过挤出式3D 打印构建骨组织工程支架,具有高度可控的孔结构。Li 等[21]通过3D 打印并烧结得到的80SiO2-15CaO-5P2O5生物玻璃支架达到人骨小梁的平均抗压强度(2～12 MPa),生物相容性良好,能促进骨细胞增殖与分化。因此,利用3D 打印技术制备 BG 支架并表面沉积 MnO2得到的BG-MnO2(BGM)复合支架,不仅具有可控的多孔结构和良好的生物活性,而且有望催化分解骨缺损处的H2O2而产生O2,有利于骨缺损修复。

已有研究报道在材料表面沉积MnO2的方法有水热法[22-23]、共沉积法[24]、自生成法[25-26]、氧化还原法[27-29]等。其中,氧化还原法操作简单,所使用的还原剂种类繁多且经济、高效(如PAH、MES、油酸等)、且沉积可控。Chen 等[30]采用氧化还原法在α-NaYbF4: Tm@CaF2纳米颗粒溶液中添加MES 缓冲液和KMnO4溶液,在α-NaYbF4: Tm@CaF2颗粒表面均匀生长MnO2纳米片,制备成复合纳米颗粒并成功用于生物成像和生物检测。Wang 等[31]在PtCo 纳米粒子溶液中添加 MES 缓冲液,溶液能够制备具有高催化活性的单分散球形MnO2@PtCo 花状结构,其在正常和缺氧环境中对正常NIH 3T3 细胞几乎没有细胞毒性。因此,氧化还原法有望实现MnO2在BG 支架表面的可控沉积而制备得到BGM复合支架。

基于上述研究进展,本研究提出在3D 打印的BG支架表面,采用简单的氧化还原法可控沉积MnO2制备BGM 复合支架,研究了MnO2含量对BGM 支架结构、理化性能以及催化分解H2O2生成O2的影响,初步探究了BGM 支架的体外生物学性能。

1 实验方法

1.1 实验材料

正硅酸四乙酯(TEOS,98%)、磷酸三乙酯(TEP,99.8%)、四水合硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O,99%)、浓盐酸(HCl,37%)、吗啉乙磺酸(MES)、高锰酸钾(KMnO4)、过氧化氢(H2O2,30%)均购于国药集团化学试剂有限公司。聚乙烯醇(PVA,分子量 : 146000～186000,＞99%)购于Sigma-Aldrich。

1.2 BGM 支架的制备

采用溶胶-凝胶方法[32]制备用于3D 打印BG 支架的BG 粉体,配制打印浆料前,用行星球磨机球磨BG 粉体8 h,然后经400 目(38 µm)筛子过筛后备用。3D 打印BG 支架的粘结剂为10% PVA 溶液,即将PVA (5 g)加入去离子水(45 g)后加热至95 ℃并持续搅拌6 h 得到。BG 支架制备过程如下: 首先将10% PVA 溶液与BG 粉末以1 : 1 的重量比进行充分混合,形成均匀的糊状浆料;接着将浆料转移到打印料仓中并固定在3-D BioplotterTM(EnvisionTEC GmbH,Germany)打印机上;然后打印机通过导入的模型控制打印头挤出一排排杆状纤维并组成栅格状的φ=10 mm 圆形二维平面,相邻平面的纤维以60°夹角排列,层层堆叠形成3D 多孔素坯支架,其中注射泵的气体压力为250～350 kPa,打印速度为4～6 mm/s,针头尺寸为400 μm;最后干燥的素坯支架在管式炉中升温至300 ℃ (1 ℃/min)并保温2 h,再将温度升高至1050 ℃ (3 ℃/min)并保温3 h 得到BG 支架。

BGM 支架的制备: 据文献[33-34]方法用去离子水配制pH 6的MES缓冲溶液(4-Morpholineethanesulfonic acid hydrate,0.1 mol/L)和KMnO4溶液(0.01 mol/L)。将BG 支架放入MES 缓冲液超声10 min,支架质量与MES 体积比例为25 mg : 1 mL;然后每10 mL MES 溶液中分别加入1、5、9 mL 的KMnO4溶液,继续超声30 min;最后取出支架用去离子水冲洗三次,60 ℃烘箱中干燥24 h,得到BGM 支架。依据添加的KMnO4量依次命名为BGM1、BGM5 和BGM9支架。

1.3 BGM 支架的理化性能表征

采用场发射电子扫描显微镜(Scanning electron microscope,SEM,FEI Quanta 450,America)观察BGM 支架的表面形貌与微结构,同时采用能谱仪(Energy disperse spectroscopy,EDS)分析BGM 支架的表面元素组成及含量。将支架研磨成粉末后用X 射线粉末衍射仪(XRD,Bruker D8 Advance,America)测定其广角X射线衍射图谱,2θ扫描范围为10°～80°,扫描速率为7 (°)/min。

以去离子水为介质,采用阿基米德原理测定支架的孔隙率。孔隙率(P)根据以下公式计算:

P=(Wsat-Wdry)/(Wsat-Wsus)×100%,

其中,Wdry是支架的干重,Wsus是支架悬浮在水中的重量,Wsat是支架浸没在去离子水中的重量。

通过万能材料试验机(2.5 kN,Zwick-Roell,Germany)以5 mm/min 的位移速度测定支架的抗压强度。每组BGM 支架的平行样本为3 个。

支架体外矿化: 将支架与模拟体液(Simulated body fluid,SBF)以200 mL/g 的比例静置于离心管中,到预定时间后轻轻取出支架,用去离子水清洗表面后烘干备用。将支架用研钵研碎,取少量粉末与KBr 粉末混合压片,采用傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR,PerkinElmer SPECTRUM 100,Germany)测定矿化前后支架的FT-IR 谱图,谱图扫描范围为2000～450 cm-1。

支架体外降解性能: 将支架浸泡在37 ℃的Tris-HCl 缓冲溶液中,经过1、2、3、5、7、14、21、28 d 后,取出、洗涤、烘干后称量支架的剩余重量,其中Tris-HCl缓冲液体积与支架质量的比例为200 mL/g,并且在每次称重后重新加入相应比例的Tris-HCl 缓冲液。另外,将支架置于37 ℃的新鲜SBF 中测试支架所在溶液持续14 d 的pH 变化,其中SBF 体积与支架质量的比例为200 mL/g。

1.4 BGM 支架催化过氧化氢产生氧气

通过便携式溶解氧测定仪(JPB-607A)测试溶液的饱和氧浓度。为了测定BGM 支架对H2O2的催化产氧能力,首先将测试氧电极探针插入配制的H2O2溶液中以实时记录溶液的氧浓度。待数值稳定后,将支架放入待测浓度的H2O2溶液中,通过测定仪上的数值实时记录溶解氧浓度随时间变化的情况。分别测试BGM 支架在不同浓度H2O2溶液中的饱和氧浓度变化。每组测试进行三组平行试验,其中H2O2溶液与支架的比例为200 mL/g。

1.5 细胞实验

采用兔源骨髓间充质干细胞(rBMSCs)进行体外细胞实验。细胞采用DMEM 培养基培养,其中DMEM 培养基含有10%牛胎血清(FBS),4.5 g/L 的葡萄糖(Gibco,Carlsbad,CA)和抗生素(青霉素,100 U/mL;链霉素,0.1 mg/mL)。将灭菌锅灭菌(121 ℃,30 min)的BG 和BGM 支架置于24 孔板内,然后向每个支架滴加200 μL 含1×105rBMSCs 的细胞悬液,30 min 后加入培养基没过支架,并在37 ℃、5% CO2的气氛培养箱内孵育。

通过 CCK-8(Cell counting Kit-8) 方法评估rBMSCs 在支架上的增殖情况。各组支架接种rBMSCs后分别培养1、3 和7 d,向各孔中加入360 μL 的培养基和40 μL 的CCK-8 溶液,继续在37 ℃、5% CO2气氛培养箱中培养4 h。然后在每个孔中取出100 μL溶液转移到新的96 孔板中,并使用酶标仪(BioRad 680,USA)测试450 nm 处的OD 值,用以定量表征细胞增殖情况。

通过测试碱性磷酸酶活性(Alkaline Phosphatase,ALP)的表达来分析各组支架上的细胞初期成骨分化状况。将接种rBMSCs 的支架培养3 和7 d 后,使用PBS 和Tris-HCl 缓冲液清洗三次。接着,使用200 μL的0.2%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)溶液溶解细胞,超声分散后在4 ℃下14000 r/min 离心。然后,取50 μL 上层清液与150 μL 标准试剂混合,在酶标仪405 nm 处读取OD 值。同时,按检测试剂盒说明,作蛋白定量检测,最后碱性磷酸酶活性以OD (min·(mg protein)-1)表示。

2 结果与讨论

2.1 BGM 支架结构表征

图1(A)为BG 和BGM 支架的光学照片。由图可见,BG 支架为白色,而随着制备过程中KMnO4的添加量增加,BGM 支架表面颜色呈现由浅黄色到深棕色的变化,且表面颜色较为均匀。这说明通过改变制备过程中KMnO4的加入量,可以调控BGM支架表面沉积MnO2的量。图1(B)为BG 和BGM 支架的广角XRD 图谱。根据图谱可知,经烧结的BG支架只在2θ=20°～30°存在宽化的馒头峰,并且没有其他明显的衍射峰。而BGM1、BGM5、BGM9 支架在2θ=18.06°处存在衍射峰,对应MnO2的特征峰(PDF-#72-1982)。另外,随着支架表面MnO2含量的增加,2θ=18.06°处衍射峰变得更为明显,而 2θ=20°～30°处的馒头峰有所下降。由此表明BG 支架表面成功沉积了不同含量的MnO2。

图1 (A)BG 和BGM 支架的光学照片及(B)XRD 图谱Fig.1 (A) Optical picture and (B) XRD patterns of BG and BGM scaffolds

图2为BG 和BGM 支架的SEM 照片及相应的表面EDS 谱图。由图可以看出,BG 支架在沉积MnO2前后的宏观结构没有变化,都呈现有序排列且三维连通的多孔结构,表明氧化还原法沉积MnO2不会破坏支架的宏观结构。另一方面,随着沉积过程中KMnO4的添加量增加,支架表面沉积的细小MnO2颗粒从无到有,且逐渐增加。由EDS 能谱分析可知,BG 支架表面没有Mn 元素,而BGM 支架表面则探测到明显的Mn 元素;BGM1、BGM5 和BGM9 支架表面的Mn 元素在支架表面的重量占比分别为0.41%、0.94%和1.18%。以上结果也表明通过氧化还原法可成功将MnO2沉积在BG 支架表面,并且可以通过沉积过程中KMnO4含量控制而调控MnO2的沉积量。

图2 BG 和BGM 支架的(A1,A2,B1,B2,C1,C2,D1,D2) SEM 照片和相应的(A3,B3,C3,D3)EDS 图谱Fig.2 (A1,A2,B1,B2,C1,C2,D1,D2) SEM images and corresponding (A3,B3,C3,D3) EDS spectra of BG and BGM scaffolds(A1,A2,A3) BG scaffold;(B1,B2,B3) BGM1 scaffold;(C1,C2,C3) BGM5 scaffold;(D1,D2,D3) BGM9 scaffold

2.2 BGM 支架的孔隙率和机械强度

通过阿基米德方法测试计算得到的BG 和BGM支架的孔隙率如图3(A)所示。BG、BGM1、BGM5和 BGM9 支架的孔隙率分别为(78.28±0.38)%、(76.81±1.15)%、(78.12±0.67)%和(77.53±0.97)%。各组支架之间的孔隙率没有明显的差异,说明BG 支架表面沉积的MnO2颗粒没有对支架的连通性和大孔结构造成影响。

BG 和BGM 支架的抗压强度如图3(B)所示。可以看出,随着支架表面沉积MnO2含量的增加,支架的抗压强度呈上升趋势。BG、BGM1、BGM5和BGM9支架的抗压强度分别为(2.21±0.15)、(2.61±0.32)、(3.09±0.13)和(3.45±0.39) MPa。从力学强度考虑,BGM 支架均在2 MPa 以上,满足人体松质骨的最低抗压强度要求[35]。这里BGM 支架可能因MnO2细小颗粒能够沉积在支架表面的细小孔隙中而改善支架的抗压强度。Azizi 等[36]研究发现沉积MnO2的羟基磷灰石复合支架也同样获得了比纯羟基磷灰石支架更高的抗压强度

图3 BG 和BGM 支架的(A)孔隙率和(B)抗压强度Fig.3 (A) Porosities and (B) compressive strengths of BG and BGM scaffolds (* p＜ 0.05,** p＜ 0.01)

2.3 BGM 支架的矿化、降解及pH 变化

图4(A)是BG 和BGM 支架浸泡SBF 前的FT-IR谱图。由图可知,在1104、801 和472 cm-1处出现Si-O官能团引起的振动峰,并且在960、604 和575 cm-1处出现了典型PO43-官能团引起的特征振动峰[21]。图4(B)是BG 和BGM 支架在SBF 中浸泡5 d 后的FT-IR 谱图。相较于浸泡SBF 前的BG 和BGM 支架,各组支架在SBF 浸泡5 d 后的特征振动峰均有所增强,而且其振动峰的增强随支架表面MnO2含量的增加而更加显著,说明MnO2沉积有利于支架表面的磷酸盐物质生成。这可能是因为支架表面沉积的MnO2颗粒可以成为羟基磷灰石成核位点,有利于羟基磷灰石生成。因此,BGM支架具有生物活性。

图4 BG 和BGM 支架(A)浸泡SBF 前和(B)浸泡SBF 5 d 后的FT-IR 谱图Fig.4 FT-IR spectra of BG and BGM scaffolds (A) before and (B) after soaking in SBF for 5 d

图5(A)是BG 和BGM 支架在Tris-HCl 溶液中浸泡28 d 的降解曲线。由图可知,各组支架的降解速率接近,经过Tris-HCl 溶液浸泡28 d,各组支架质量都约减15%。这说明BGM 支架表面的MnO2对支架降解的影响较小。图5(B)为BG 和BGM 支架在SBF 中浸泡14 d 的pH 变化曲线。由图可见,前三天各组支架浸泡后的溶液pH 呈上升趋势,之后其pH 变化不大。这可能是由于前期支架中的Ca、P、Si 离子释放使溶液pH 有一定程度上升,而之后支架表面沉积羟基磷灰石使得溶液中离子交换变缓,pH 变得相对稳定。另一方面,浸泡BG、BGM1、BGM5 和BGM9 支架的SBF 在第三天的pH 分别为(7.54±0.01)、(7.53±0.02)、(7.55±0.02)和(7.56±0.02),说明MnO2作为一种两性氧化物对支架在SBF 中的pH 影响不大。当支架周围环境的pH 与人体体液接近或呈弱碱性时,有利于新生骨生长,并且稳定的pH 环境也是成骨细胞黏附增殖的关键。

图5 (A)BG 和BGM 支架在Tris-HCl 中浸泡28 d 的降解曲线及(B)BG 和BGM 支架在SBF 中浸泡14 d 的pH 变化曲线Fig.5 (A) Degradation curves of BG and BGM scaffolds in Tris-HCl for 28 d,and (B) pH change curves of SBF after BG and BGM scaffolds soaking for 14 d

2.4 BGM 支架催化H2O2 产生氧气

MnO2通过催化分解H2O2可以在溶液中产生一定浓度的饱和氧。图6(A)是BGM9 支架在不同浓度H2O2溶液中产生的饱和氧浓度曲线,从图中可以看出,随着H2O2浓度增加,溶液中的饱和氧浓度逐渐升高,在20 mmol/L 的H2O2溶液中,BGM9 支架使其饱和氧浓度最高时达到平均 25.37 mg/L,远远高于不含H2O2的去离子水溶液中所测得的饱和氧浓度6.53 mg/L。Hsieh等[37]研究发现PLGA/CaO2/MnO2复合纳米颗粒能够使溶液中的饱和氧浓度达到10～12 mg/L,并且有效缓解低氧张力下细胞生长的缺氧状态,促进其成骨分化。一般情况下人体内的H2O2浓度在1～8 μmol/L,而巨噬细胞活化后可产生局部高浓度的H2O2(0.01～1 mmol/L)[38-39]。此外,在炎症性疾病中的H2O2浓度可能达到20 mmol/L,这取决于炎症环境中的中性粒细胞[40]。许多H2O2响应材料在H2O2浓度为0.02～5 mmol/L 的模拟炎症环境中进行相关测试[41-43]。本研究中BGM9 支架能够使含H2O2的模拟炎症环境(2 mmol/L) 中的饱和氧浓度达到(11.00±0.36) mg/L,这有缓解细胞缺氧环境的效果,有利于细胞的增殖与分化。本实验对BGM 支架在H2O2(2 mmol/L)溶液中的重复循环催化释放氧气能力进行了评估。图6(B)是BGM 支架在含有H2O2(2 mmol/L)溶液中重复循环三次的溶解氧变化曲线。由图可知,BGM1、BGM5、BGM9 支架分别使溶液的饱和氧浓度达到(6.93±0.12)、(8.40±0.26)和(11.00±0.20) mg/L。除了BGM1 支架处理的溶液中饱和氧浓度很快下降到初始溶液的饱和氧浓度外,BGM5 和BGM9 支架处理的溶液中饱和氧浓度分别在13 和16 min 左右才开始逐渐下降,表明支架具有持续催化释放氧气的能力。另外,将试验的支架取出后再次放入到相同浓度的H2O2溶液,其处理溶液中的饱和氧浓度只有略微下降,说明BGM 支架表面的MnO2与支架产生较强的结合力,并且表面沉积的MnO2没有在催化过程中被产生的O2破坏。因此,BGM 支架在模拟人体炎症环境中具有持续的催化分解H2O2产生氧气的能力。

图6 (A)BGM9 支架在不同浓度H2O2 溶液中的溶解氧水平和(B)BGM 支架在 2 mmol/L H2O2溶液中溶解氧变化曲线(连续循环测试3 次)Fig.6 (A) Dissolved oxygen levels in different concentrations of H2O2 solution after immersing BGM9 scaffolds,and (B) dissolved oxygen change curves in 2 mmol/L H2O2 solutions after immersing BGM scaffolds (cycle test for 3 times)

2.5 BGM 支架的细胞实验

图7(A)是CCK-8 法检测rBMSCs 在BG 和BGM支架上培养1、3 和7 d 的细胞增殖状况,可以看到,随着细胞培养时间延长,BG 和BGM 支架上的细胞明显增殖。另一方面,当细胞在各组支架上培养3和7 d 后,BGM1 和BGM5 支架上细胞增长率显著高于BG 支架,而BGM9 支架组则显示出与BG 支架组相近的细胞增长率,表明BGM1 和BGM5 支架能够促进rBMSCs 增殖。细胞在BGM 支架上的增殖一方面取决于支架释放的具有生物活性的Si、Ca离子和支架周围稳定的pH 环境[44-45]。另一方面,BGM支架表面释放适量的Mn离子也能促进成骨细胞的黏附与增殖[46]。

图7 (A)rBMSCs 细胞在BG 和BGM 支架上的增殖和(B)ALP 活性Fig.7 (A) Proliferation and (B) ALP activity of rBMSCs on BG and BGM scaffolds

通过分析细胞在BG 和BGM 支架上的ALP 活性情况,进一步评估了rBMSCs 在BG 和BGM 支架上的初期成骨分化能力。图7(B)是rBMSCs 在BG和BGM 支架上培养3 和7 d 的ALP 活性表达水平。随着细胞培养时间延长,BG 和BGM 支架组的ALP活性都随之增大。当细胞在各组支架上培养3 d 时,BGM1 和BGM5 支架组的ALP 活性明显高于BG支架组,而BGM9 支架组的ALP 活性接近BG 支架组。当细胞在各组支架上培养7 d 时,BGM5 和BGM9 支架组的ALP 活性明显高于BG 支架组。这说明BGM5 支架对rBMSCs 有较好的成骨分化促进作用。

3 结论

本研究采用简单的氧化还原法在3D 打印制备的BG 支架表面沉积MnO2纳米颗粒,得到了BGM复合支架。通过调节KMnO4溶液浓度可以调控BGM 支架表面MnO2的沉积量。BGM 支架具有规则的连通多孔结构,且不同MnO2量的BGM 支架具有相近的孔隙率和降解速率。随着沉积MnO2量的增加,BGM 支架的抗压强度也明显增加。更为重要的是,BGM 支架能够催化分解 H2O2产生氧气,BGM5 和BGM9 支架在2 mmol/L H2O2溶液中持续产生氧气,饱和氧浓度分别达到8.4 和11 mg/L。细胞实验结果表明BGM 支架对细胞增殖和成骨分化具有促进作用。因此,BGM 支架具有消除骨缺损处过量H2O2并缓解缺氧状态的功能,在骨缺损修复领域具有较大的应用潜力。