葛根素穴位注射预处理对布比卡因诱发的心肌损伤影响及机制探讨

于 妍，王春爱，秦晓宇，李玉兰，梁 曦，温晓辉，刘 敏

(1. 甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2. 甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730030；3. 兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730030；4. 甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730030)

手术过程中常采取局部麻醉的方式来减轻患者疼痛，以提高手术成功率，但局麻药有一定不良反应，甚至会因心血管系统毒性导致死亡[1-2]。布比卡因是一种酰胺类的长效局麻药，具有快速起效的优势，以推荐剂量使用比较安全[3]，因此在临床上广泛应用。然而，布比卡因过量或误入静脉仍会导致明显的不良反应，其中心脏毒性较常见，可表现为心律失常、心搏骤停等[4]；其还可以直接抑制线粒体呼吸链复合体I(MRCC-I)，影响线粒体能量产生，并导致线粒体中活性氧(ROS)的产生，触发凋亡的线粒体途径[5-7]。目前研究认为，兼具针刺和药物治疗双重作用的穴位注射疗法在辅助麻醉及心律失常治疗领域发挥着重要作用[8-9]。关于心肌保护作用的研究显示，葛根中有效成分葛根素可通过靶向作用于线粒体而保护心肌[10]，电针内关穴可通过调节线粒体能量代谢的各种信号减轻心肌缺血再灌注损伤[11]。基于此，本研究从调节线粒体功能角度探讨了内关穴葛根素注射液预处理对布比卡因诱发的心肌损伤的影响。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠40只，6月龄，体重250～300 g，由兰州兽医研究所实验动物中心提供,动物合格证号：SCXK[甘]2019-0002。实验遵循美国国家卫生研究院《实验动物使用指南》，并经甘肃省中医院伦理委员会批准(2019-005)。

1.2药品与试剂 盐酸布比卡因注射液(上海朝辉药业有限责任公司,批号:1404113)，葛根素注射液(成都天台山制药有限公司,批号:180201)；the RNeasy Mini试剂盒、the QuantiNova SYBR Green PCR试剂盒、the QuantiNova Reverse Transcription 试剂盒购自QIAGEN公司，大鼠细胞色素C氧化酶(Rat COX) ELISA试剂盒购自CUSABIO公司，单胺氧化酶(MAO)ELISA试剂盒购自Elabscience公司，解偶联蛋白2(UCP2)抗体(Anti-UCP2)、腺嘌呤核甘酸转运子1(ANT1)抗体(Anti-ANT1 )购自GeneTex公司，电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)抗体(Anti-VDAC1)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)抗体(Anti-Bcl-2 )购自Abcam公司。

1.3实验仪器 多道电生理记录仪(AD instruments,DBS-170)，微量注射泵(深圳圣诺医疗设备有限公司,SN-50F6)，鼠控温解剖台(北京众实迪创科技发展有限责任公司)，Power Lab数据采集分析系统(埃德仪器国际贸易有限公司)，-80 ℃冰箱(Form scientific 公司)，低温高速离心机(Sigma公司)，电子天平(Sartorius公司)，酶标仪(美国Thermo公司)。

1.4实验方法 采用随机数字表法，将40只雄性Wistar大鼠分为空白组、布比卡因组、葛根素治疗组、葛根素预防组，每组10只。大鼠禁食不禁饮8 h后，采用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定于实验台，分别于左侧股静脉和右侧颈动脉置入24 G套管针用于给药和监测动脉血压及采集血样，采用PowerLab系统监测血压和Ⅱ导联心电图。空白组大鼠不给予布比卡因，仅在双侧内关穴(前肢内侧离腕关节约3 mm尺桡骨缝间)注入生理盐水各0.1 mL；布比卡因组和葛根素治疗组均参照文献[12]的方法经股静脉2 min内输注0.5%布比卡因10 mg/kg，当Ⅱ导联心电图出现心律失常(频发室性早搏、室性心动过速、QRS延长20%)后，分别立即在双侧内关穴注入生理盐水和葛根素注射液各0.1 mL；葛根素预防组在双侧内关穴注入葛根素注射液各0.1mL后5min，输注0.5%布比卡因10 mg/kg(该组大鼠在实验过程中均未出现恶性心律失常)。

1.5检测指标及方法 于注入生理盐水(空白组)或注入利多卡因的第8 min处死各组大鼠，取左室心肌组织，分离心肌细胞线粒体。

1.5.1心肌细胞中COX、MAO活性 取心肌细胞线粒体，按照试剂盒说明，采用 ELISA法检测COX、MAO活性。

1.5.2心肌细胞中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2蛋白表达情况 采用Western blot法检测：用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白浓度。采用10% SDS-PAGE分离蛋白，转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后，分别加入Bcl-2(1∶2 000)、VDAC1(1∶2 000)、UCP2(1∶2 000)、ANT1 (1∶2 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗在4 ℃过夜，PBST冲洗后，加入辣根过氧化物酶结合的二级抗体(1∶5 000)在37 ℃下孵育1 h。使用ECL试剂盒进行条带分析，使用Image J 1.42q软件程序计算相对表达量。

1.5.3心肌细胞中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2 mRNA表达情况 采用RT-PCR法检测：用TRIzol试剂盒提取总RNA，以总RNA(0.5 μg)为原料，反式合成cDNA转录系统。随后，cDNA用GoTaq-qPCR母料进行实时聚合酶链反应(PCR)。反应在7500实时荧光定量PCR系统上进行，具体引物序列见表1。使用ΔΔCt方法计算每个基因表达的倍数变化，倍数变化值用2-ΔΔCt表示。

表1 UCP2、VDAC1、ANT1、Bcl-2基因引物序列

2 结 果

2.1各组大鼠心肌线粒体中MAO、COX活性比较与空白组比较，布比卡因组大鼠心肌线粒体中MAO活性明显升高(P<0.05)，COX活性明显降低(P<0.05)；与布比卡因组比较，葛根素治疗组和葛根素预防组大鼠心肌线粒体中MAO活性均明显下降(P均<0.05)，葛根素治疗组大鼠心肌线粒体中COX活性无明显变化(P>0.05)，葛根素预防组大鼠心肌线粒体中COX活性明显升高(P<0.05)；葛根素治疗组和葛根素预防组大鼠心肌线粒体中MAO、COX活性比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 空白组和布比卡因造模各组大鼠心肌线粒体中MAO、COX活性比较

2.2各组大鼠心肌线粒体中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2蛋白表达情况比较 与空白组比较，布比卡因组大鼠心肌线粒体中VDAC1、UCP2、ANT1蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)，Bcl-2蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)；与布比卡因组比较，葛根素治疗组和葛根素预防组大鼠心肌线粒体中VDAC1、UCP2蛋白相对表达量及葛根素预防组大鼠心肌线粒体中ANT1蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)，葛根素治疗组和葛根素预防组大鼠心肌线粒体中Bcl-2蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)；葛根素治疗组和葛根素预防组大鼠心肌线粒体中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1及表3。

表3 空白组和布比卡因造模各组大鼠心肌线粒体中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2蛋白相对表达量比较

图1 空白组和布比卡因造模各组大鼠心肌线粒体中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2蛋白表达情况

2.3各组大鼠心肌线粒体中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2 mRNA表达情况比较 与空白组比较，布比卡因组大鼠心肌线粒体中VDAC1、UCP2、ANT1 mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05)，Bcl-2 mRNA相对表达量明显降低(P<0.05)；与布比卡因组比较，葛根素治疗组和葛根素预防组大鼠心肌线粒体中VDAC1、UCP2、ANT1 mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05)，Bcl-2 mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05)；葛根素治疗组和葛根素预防组大鼠心肌线粒体中VDAC1、UCP2、ANT1、Bcl-2 mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

表4 空白组和布比卡因造模各组大鼠心肌线粒体中VDAC1、UCP2、ANT1 、Bcl-2 mRNA相对表达量比较

3 讨 论

线粒体通过氧化磷酸化为细胞供能，线粒体电子传递和氧化磷酸化发生障碍可抑制ATP的产生，细胞内ATP减少，呼吸链电子漏出活性氧增加，线粒体膜电位降低，促进通透性转换孔(MPTP)的开放，最终导致细胞凋亡[12]。目前研究证实，线粒体损伤可导致心脏毒性[13-14]。COX作为线粒体内膜的标志性酶，是线粒体氧化磷酸化的关键调节部位，在ATP产生中起主要作用；MAO是线粒体外膜的标志性酶，其活性的增高与线粒体氧化应激损伤有关[15]。VDAC和ANT是MPTP 的组成部分，对MPTP开放起主要调节作用[16]；UCP是线粒体内膜上参与能量代谢的重要转运蛋白，与电子漏出活性氧有关[17]；Bcl-2主要定位在线粒体外膜上，通过作用于MPTP起到抗凋亡作用[18]。

李振辉等[19]研究显示，布比卡因可导致心肌细胞活性和线粒体膜电位降低,线粒体发生髓样变和空泡样变，推测心肌细胞线粒体功能障碍是其导致心脏毒性的机制之一。国外的相应研究显示，布比卡因可使部分线粒体呼吸链复合体的活性下降，电子传递障碍，影响线粒体能量代谢，导致MPTP开放[6]。本实验结果显示，布比卡因可增强心肌线粒体中MAO活性，促进VDAC1、UCP2、ANT1蛋白及mRNA表达，抑制COX活性和Bcl-2蛋白及mRNA表达，损伤线粒体功能，产生心肌毒性，再次证明布比卡因的心肌细胞毒性作用与线粒体有关。

目前研究认为葛根素注射液具有明显心肌保护作用。课题组前期大鼠实验发现，葛根素内关穴注射可通过增强心肌组织中Na+，K+-ATP 酶活性和抑制乳酸脱氢酶(LDH)活性，减轻布比卡因的心脏毒性[20]，内关穴注射葛根素融合了经络、腧穴、药物效应的作用。本实验结果显示，葛根素治疗组和葛根素预防组大鼠心肌线粒体中MAO活性及VDAC1、UCP2蛋白相对表达量均明显低于布比卡因组，心肌线粒体中Bcl-2蛋白相对表达量均明显高于布比卡因组，且葛根素预防组大鼠心肌线粒体中COX活性明显高于布比卡因组，ANT1蛋白相对表达量明显低于布比卡因组。提示穴位注射葛根素可以减轻布比卡因造成的线粒体功能损伤，且葛根素预处理作用更明显，但其具体调节机制尚待进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。