银杏类黄酮合成关键基因的鉴定和GbANR2的基因的克隆

季雅菲

（中国农业大学，北京 100089）

1 引言

1.1 背景介绍

银杏（Ginkgo bilobaL.）俗称“白果”，为我国特有珍贵树种，在植物界享有“活化石”之称，集生态防护、观赏、经济等价值为一体，具有良好开发前景和研究价值[1]。

类黄酮是大多数植物中含量较多的一类次生代谢物，原花青素是类黄酮中的主要成分之一，主要由花青素还原酶（ANR）调控合成[2]。由于原花青素等黄酮类化合物能为农作物提供良好性状，提高食品的保健作用，还可以为转基因材料着色[3]，故而该类化合物的合成途径的相关研究逐渐受到人们的关注。

1.2 研究目的及意义

近年来，研究者已经相继从一些植物中，如杉木、拟南芥中克隆了ANR 基因，并进行了相关的遗传和生化研究，但是银杏GbANR2基因的克隆与表达分析的分子机制鲜有报道[4-5]。本研究以类黄酮合成途径为切入点，通过基因共表达分析鉴定出合成途径中的关键结构基因，对关键基因GbANR2进行了基因克隆，并对其进行生物学分析。本研究将为明确GbANR2对银杏类黄酮的合成的作用提供理论基础，为定向培育高类黄酮含量的优质银杏植株提供理论基础。

2 材料方法

2.1 银杏黄酮类化合物合成相关结构基因的共表达分析

从NCBI Sequence Read Archive（SRA）数据库（https://github.com/ncbi/sra-tools）中下载126 个银杏样本的高质量转录组（RNA-seq）数据，对其进行数据处理获得126 个样品中所有基因的表达数据[7-8]。将通过KEGG 鉴定出的银杏类黄酮合成途径中的48个结构基因进行基因共表达分析，计算所有基因之间的皮尔森相关系数（PCC），筛选PCC＞0.75 的基因，并利用Cytoscape软件实现基因的共表达网络的可视化。

2.2 GbANR2基因克隆

2.2.1 试验试剂

本试验所用的主要试剂有：RNA 试剂盒（Omega，R6827-01，广州）、反转录MonScript™RTIII All-in-One Mix with dsDNase 试剂盒、Phanta®Max Super-Fidelity DNA 高保真酶试剂盒、大肠杆菌感受态细胞（Tsingke，TSC01，北京）、DL5000DNA Marker（Tsingke，TSJ012-500，北京）、pClone007 Blunt Simple Vector Kit载体试剂盒、TAE溶液、ddH2O无菌水。

2.2.2 基因克隆

（1）RNA 提取及纯度测定。试验过程中的RNA 提取步骤按照试剂盒（Omega，R6827-01，广州）说明进行。摘取银杏幼叶，磨样、涡旋、孵育、离心、涡旋，直至所有样品转移到色谱柱中。加入RWF洗涤缓冲液，丢弃滤液和收集管。

（2）引物设计。提取DNA 甲基化相关基因CDS 序列，使用Primer Primier 程序设计引物，采用直接扩增的方式进行克隆。正向引物（5’-3’）为ATGGCACCGCAGGCTTATCC，反向引物（5’-3’）为TTAGCAGGTAAGCAAGCCCTTGG。

（3）目的片段凝胶回收。切下含目的DNA 片段凝胶，加入等倍体积的Buffer GDP，水浴，短暂离心，将FastPure DNA Mini Columns-G 吸附柱置于Colletion Tubes 2 mL 收集管中，将≤700 μL的溶胶液转移至吸附柱中，将滤液弃除，吸附柱置于收集管中。静置，滤液弃除，重复前一步骤，将吸附柱置于在离心管中，加入Elution Buffer 至吸附柱中央，静置，弃去吸附柱，离心管存于-20°C。

（4）目的片段连接与转化。取100 μL大肠杆菌感受态细胞，加入连接产物，静置。将其放入水浴中激活45 s，静置。加入无抗性SOC/LB 培养液，摇1 h。将复苏液涂抹至含氨苄青霉素（Amp）的培养基上，倒置过夜12～16 h。

2.3 GbANR2生物信息学分析

2.3.1GbANR2基因结构分析及染色体定位

基于银杏基因组数据库中基因的位置信息，运用TBtools软件实现目的基因的基因结构的可视化。

2.3.2GbANR2蛋白结构预测

利用SWISS-MODEL 在线软件分析银杏ANR 蛋白三维结构模型，并与蛋白质二级结构预测结果进行比较。

2.4 GbANR2在银杏不同组织中的表达

选取银杏成年根（R）、成年茎（S）、未成熟叶片（IL）、成熟叶片（ML）、雌球果（OS）、大孢子叶球（M）、未成熟果实（IF）与成熟果实（MF），利用GraphPad 进行作图，分析GbANR2 在银杏不同组织中的表达量。

3 结果分析

3.1 基因共表达分析鉴定银杏类黄酮合成途径的核心结构基因

利用处理后的126 个银杏公共转录组数据[6]，对48 个类黄酮合成结构基因进行共表达分析（PCC＞0.75），筛选出12个高度相关的核心基因[7]，这些基因在类黄酮合成中发挥重要作用，现将其定义为参与类黄酮合成的核心基因。分别为CHS5、4CL2、DFR2、F3’H1、ANR3、PAL4、CHS1、ANS1、ANR2、CHI、CHS4、F3H1。

3.2 GbANR2基因克隆

3.2.1 目的基因的扩增与纯化

以cDNA 为模板，利用Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase 进行GbANR2（Gb_10028）基因克隆，如图1，将所有的PCR 产物进行电泳检测并且进行切胶回收、转化和阳性克隆鉴定。

图1 类黄酮通路相关核心结构基因的共表达分析Fig.1 The analysis on coexpression of core structure genes relatedto flavonoid pathway

3.2.2 克隆序列比对

将擎科公司测序结果使用NCBI 网站进行分析，将测序结果与原DNA 序列输入进行比对，根据多序列比对结果可知，克隆序列与目的基因的序列完全相同，大小为1029bp，编码341个氨基酸。

3.3 GbANR2的生物信息学分析

3.3.1GbANR2的基因结构和染色体定位

运用TBtools 进行基因结构可视化分析，得出GbANR2基因分布在3号染色体上，具有4个内含子、5个外显子，长度为1029bp。通过DANMAN 软件对GbANR2碱基序列进行翻译，得到由341个氨基酸组成的蛋白质。

3.3.2GbANR2同源性分析

使用Blast 将GbANR 序列与其它植物的ANR 基因序列进行比对，结果显示GbANR 基因的核苷酸序列与其它植物的ANR基因的核苷酸序列同源性非常高，尤其是裸子植物的白云杉和北美云杉，相似性分别为74.44%和74.24%，说明GbANR 与来自裸子植物的ANR 具有较近的亲缘性。此外，GbANR 与日本柳杉、野茶树、苹果的相似性依次为72.59%，65.32% 和64.99%。因此，从蛋白质序列比较结果推测GbANR正是银杏ANR基因家族成员之一。

3.3.3GbANR2蛋白结构预测

通过SOPMA 预测蛋白质的二级结构，结果显示，GbANR2蛋白结构中α 螺旋有141 个氨基酸，所占比例为41.23%；β 转角有27 个氨基酸，所占比例为7.89%，延伸链（Extended strand）有50 个氨基酸，所占比例为14.62%，无规则卷曲（Random coil）有124 个氨基酸，所占比例为36.26%。使用Swiss-model 对GbANR2蛋白的三级结构进行预测，结果显示，GbANR2以花青素还原酶为模板构建，两者蛋白的三级结构相似性为59.16%，模型主要包括12 个α 螺旋与10个β 转角。

3.4 GbANR2在银杏不同组织中的表达

银杏发育过程中，GbANR2基因在根、茎中表达量较低，而生长初期相反，表达量较高，而后又迅速下调，使花青素得以积累。在不同的银杏组织中，ANR 基因的表达量均有所不同，依次是IF＞OS＞IL＞MF＞R＞S＞ML＞M ,表达量结果差异显著。

4 结语

本研究从银杏公共数据库中下载了银杏转录组数据126个，对原始数据进行处理和均一化，以皮尔森相关系数PCC＞0.75 为标准，鉴定出12 个关键核心基因。其中GbANR2基因与其它基因的相互调控关系较为紧密，对该基因进行了克隆，并对其在染色上位置、基因结构、蛋白结构，以及在不同组织中的表达量进行了分析。研究表明ANR基因在在根、茎中的表达量较低，在叶、果实中的表达量较高，ANR基因在植物特定器官表达中起重要作用。

类黄酮在银杏叶中具有重要作用，因此研究银杏类黄酮代谢途径，并利用相关基因进行有效的调控是获得高产类黄酮的基础。本研究鉴定了银杏类黄酮合成关键基因，克隆了银杏GbANR2基因。为了更好得进行后续研究，可以从银杏幼叶中选取表达量较高的其它核心基因进行克隆，为研究银杏类黄酮合成途径提供丰富的理论依据。